左金方中吴茱萸药材UPLC 指纹图谱的建立及药材质量评价*

李艳英，郭敏群，魏宏伟，王洪成，杨秀伟

1 北京盈科瑞创新医药股份有限公司，北京 102200； 2 北京大学，北京 102200；3 盈科瑞（天津）创新医药研究有限公司，天津 300000

左金方出自《丹溪心法》，由黄连、吴茱萸两味药材组成，以疏肝清肝、苦寒的黄连为君药，使肝气条达且不上冲犯胃，佐以少量性味辛热的吴茱萸，辛开苦降、相反相成［1］。目前，左金方主要用于治疗消化系统疾病，如幽门杆菌感染、消化性溃疡等［2］。除此之外，临床及实验研究发现，用左金方或加减配伍，或调整黄连、吴茱萸的用量比例，或与其他药物联合使用，能广泛治疗消化道疾病以外的属“肝经火旺”证的诸多疾病，如失眠、高脂血症、高血压、眩晕、巅顶痛、胁痛、乳房疼痛、牙痛、妊娠期呕吐、睾丸肿痛、尿毒症、梅核气、小儿脐炎等［3］。

吴茱萸来源于芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.、石虎Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.officinalis（Dode）Huang 或疏毛吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.var.bodinieri（Dode）Huang 的干 燥近成熟果实［4］。研究表明，吴茱萸含有生物碱、苦味素、挥发油、黄酮等成分，其中生物碱和苦味素为其主要有效成分［5］。产地来源和采收时期不同易出现药材质量差异，直接影响方剂的药效。本研究建立吴茱萸UPLC 指纹图谱并进行主成分分析，结合有效成分含量测定评价不同产地吴茱萸的整体质量，探讨影响吴茱萸药材质量的因素，为左金方中吴茱萸药材的质量提供依据。

1 材料与仪器

1.1 试药及试剂柠檬苦素对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110800-201406，规格：20 mg，纯度99.91%）；吴茱萸碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110802-201409，规格：20 mg，纯度99.7%）；吴茱萸次碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110801-201608，规格：20 mg，纯度99.4%）；去氢吴茱萸碱对照品（上海诗丹德标准技术服务有限公司，批号：5451，规格：20 mg，纯度99.8%）。乙腈为质谱级（赛默飞公司）；甲醇为色谱级（天津赛孚瑞有限公司）；三氟乙酸为分析纯（shanghai titian scientific 公司）；水为屈臣氏蒸馏水；盐酸为分析级（北京益利精细化学品有限公司）；乙醇为分析纯（北京化工厂）。

吴茱萸样品来源信息见表1，经盈科瑞（天津）创新医药研究有限公司中药资源研究中心主任何燕峰鉴定均为芸香科植物吴茱萸Euodia rutaecarpa（Juss.）Benth.的干燥近成熟果实。17批吴茱萸药材分别编号为S1～S17。

1.2 实验仪器Infinity 1290 Ⅱ型超高效液相色谱仪（UPLC）连接G6530C 型四极杆-飞行时间串联质谱仪（安捷伦公司）；S6000 型高效液相色谱仪（华谱科仪科技公司）；MS-204TS 型梅特勒-托利多仪器公司（万分之一）电子分析天平；XPE-105 型梅特勒-托利多仪器公司（十万分之一）电子分析天平；WT3002CF 型常州万泰天平仪器有限公司（百分之一）电子分析天平；KQ-800DB 型昆山市超声仪器有限公司超声清洗器。

2 方法与结果

2.1 指纹图谱

2.1.1 色谱条件 采用Ultimate UHPLC AQ-C18色谱柱（2.1×100 mm，1.8 µm）；以乙腈为流动相A，以0.01%三氟乙酸水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱（0～25 min，5%～11% A；25～35 min，11% A；35～50 min，11%～13% A；50～60 min，13%～20% A；60～70 min，20%～55% A；70～75 min，55%～90% A；75～80 min，90% A）；流速0.4 mL/min；检测波长300 nm，柱温30 ℃，进样量1 µL［6］。

2.1.2 对照品溶液的制备 取去氢吴茱萸碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.21 mg的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取本品粉末（过三号筛）约0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，加入甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液100 mL，超声处理（功率320 W，频率40 kHz）30 min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.4 测定法 分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各1 µL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

2.1.5 方法学考察

2.1.5.1 空白试验 取甲醇-盐酸（100∶1）的混合溶液注入超高效液相色谱仪，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果表明空白溶剂无色谱峰，对测定无干扰。

2.1.5.2 精密度试验 取编号S11 批的吴茱萸样品，按“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6 次，记录色谱图，以去氢吴茱萸为参照峰（S 峰）计算各主要特征峰（可指认的色谱峰）的相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果供试品指纹图谱呈现与参照物色谱峰保留时间相同的色谱峰，并呈现14 个主要色谱峰，其相对保留时间和相对峰面积的RSD 分别为≤0.23%和4.72%，表明仪器精密度良好。

2.1.5.3 稳定性试验 取编号S11 批次的吴茱萸样品，按“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件分别在供试品溶液制备后的0、3、6、8、12、24 h 进样测定，记录色谱图，以去氢吴茱萸碱为参照峰（S 峰），计算各主要特征峰（可指认的色谱峰）的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，14 个主要特征峰其相对保留时间和相对峰面积的RSD分别≤1.02%和4.50%，表明24 h内稳定性良好。

2.1.5.4 重复性试验 取6份编号S13批次的吴茱萸样品，按“2.1.3”项下方法制备成6 份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件依次进样，记录色谱图，以去氢吴茱萸碱为参照峰（S 峰），计算各主要特征峰（可指认的色谱峰）的相对保留时间和相对峰面积的RSD。结果表明，14 个主要特征峰其相对保留时间和相对峰面积的RSD分别≤1.24%和4.84%，表明本方法重复性良好。

2.1.6 指纹图谱方法的建立

2.1.6.1 共有峰的标定 取表1 中的17 个批次的吴茱萸样品，按“2.1.1”项下方法制备成34 份供试品溶液（每批制备两份平行样），分别按“2.1.1”项下色谱条件依次进样，记录色谱图，将数据导入国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统2012 年版”软件进行分析，以17批吴茱萸药材UPLC图谱色谱峰进行自动匹配，选择17批（34份）吴茱萸指纹图谱中稳定性较好、响应值适宜的色谱峰为共有峰，共标定了14个峰共有峰。见图1。

图1 17批吴茱萸药材指纹图谱

2.1.6.2 参照物的选择及对照指纹图谱的建立 去氢吴茱萸碱色谱峰吸收强度及保留时间适中，响应稳定，达到基线分离，故选择去氢吴茱萸碱为参照峰，标记为S 峰，同时将去氢吴茱萸碱对照品作为参照物，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统，以17批吴茱萸UPLC图谱色谱峰进行自动匹配，形成共有模式图，并建立对照图谱。见图2。

图2 吴茱萸指纹图谱共有模式

2.1.6.3 相似度的计算 采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件系统，以共有峰对17 批供试品与对照指纹图谱的相似度进行计算。相似度计算结果见表2。

表2 17批吴茱萸药材相似度分析结果

结果：17 个批次吴茱萸药材指纹图谱轮廓基本一致，相似度在0.821～0.976 之间，表明不同来源的吴茱萸药材指纹图谱轮廓基本一致，化学成分种类基本一致，S3、S5、S8、S10、S13、S17 批次的相似度低于0.90，其余批次相似度高于0.90。

2.1.6.4 共有峰的指认 通过对照品比对，对14 个共有峰进行指认，确认峰9（S）为去氢吴茱萸碱，峰10 为吴茱萸碱，峰11 为吴茱萸次碱。其余为质谱分析指认。流动相为乙腈（A）-0.05%甲酸水（B），梯度等其它色谱条件同指纹方法“2.1.1”项下质谱检测分别在正、负离子模式下进行，干燥气温度350 ℃，干燥气流速10 L/min，雾化气压力35 psi，鞘气温度350 ℃，鞘气流速12 L/min，毛细管电压4000 V（正模式）和3500 V（负模式）。一级质谱选用MS模式，质量扫描范围100～1300 m/z。二级质谱选用Auto-MS/MS 模式，碰撞电压为10、20、30 V。所 得LC-MS 数 据 由Agilent Mass-Hunter（B.08.00）软件采集［6］。数据处理采用Agilent 软件Qualitative Navigator（B.08.00）和Qualitative Workflows（B.08.00），14 个化合物质谱分析结果见表3。

表3 吴茱萸指纹图谱化学成分的MS/MS分析

2.1.6.5 指纹图谱的化学计量学分析 为了更加直观地评价不同产地吴茱萸药材的质量，采用SIMCA 13.0，以14个共有峰为变量对17批吴茱萸药材进行PCA分析，以主成分特征值大于1为提取原则，本研究提取了3 个主成分，累积贡献率达98.5%，表明该3 个主成分能代表14 个共有峰在17 批样品中的98.5%的信息，见表4。以主成分1、主成分2的得分分别为横、纵坐标，生成17批药材的主成分得分图，见图3。17 批样品主要分为两类，其中外观颜色为褐色的、成熟度较高的S3、S5、S8、S10、S13、S17 样品投影点聚集在一起；其余外观颜色为暗黄绿色及暗黄绿色至褐色、成熟度较低的S1、S2、S4、S6、S7、S9、S11、S12、S14、S15、S16 样品投影点聚在一起，与相似度评价结果一致，推断吴茱萸药材颜色深浅与药材质量存在一定的关联性。

图3 吴茱萸药材样品PCA分析得分图

表4 特征值及方差分析

按PCA 分析结果将17 批吴茱萸药材分为2组，成熟度高的果实标记为红色，成熟度较低的果实标记为蓝色，以峰面积为纵坐标，峰的序号为横坐标作图，见图4。可以看出，成熟度较低的果实峰1、2、3、5、7、8 含量高于成熟度高的果实；而峰10、11、12、13、14 含量低于成熟度高的果实。由表3 可知，峰1、2、3、5、7、8 为酚酸类成分，峰10、11、12、13、14为生物碱成分。

图4 17批吴茱萸样品成分含量比较图

2.2 吴茱萸碱、吴茱萸次碱及柠檬苦素的含量测定

2.2.1 色谱条件 按照《中华人民共和国药典》2015 年 版 的 方 法［4］，采 用ZORBA SB-C18色 谱 柱（4.6×250 mm，5.0 µm）；以［乙腈-四氢呋喃（25∶15）］-0.02%磷酸溶液（35∶65）为流动相；流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长215 nm，进样量10 µL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取吴茱萸碱对照品、吴茱萸次碱对照品、柠檬苦素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含吴茱萸碱80 µg、吴茱萸次碱50 µg和柠檬苦素0.1 mg的混合对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过三号筛）约0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 m，称定质量，浸泡1 h，超声处理（功率300 W，频率40 KHz）40 min，放冷，再称定质量，用70%乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 含量测定结果 根据《中华人民共和国药典》2015年版吴茱萸药材含量测定项下方法，对吴茱萸碱、吴茱萸次碱及柠檬苦素的含量进行检测，结果均符合规定，柠檬苦素含量范围为0.50%～2.11%；吴茱萸碱含量范围为0.09%～1.19%；吴茱萸次碱含量范围为0.07%～0.61%；吴茱萸碱和吴茱萸次碱总含量范围为0.16%～1.63%。进一步分析发现外观颜色为暗黄绿色、颜色较浅的样品柠檬苦素含量较高，吴茱萸碱和吴茱萸次碱总量较低；而外观颜色为褐色的、颜色较深的药材吴茱萸碱和吴茱萸次碱总量较高，柠檬苦素含量较低；外观颜色为暗黄绿色至褐色的，吴茱萸碱和吴茱萸次碱的总量、柠檬苦素的含量介于前两者之间，说明果实的成熟度对吴茱萸药材生物碱含量有较大影响。见表5。

表5 吴茱萸药材中3种成分的含量测定（%）

2.3 检查项、浸出物含量测定根据《中华人民共和国药典》2015 年版吴茱萸药材检查和浸出物项下方法对杂质、水分、总灰分、浸出物含量进行检测，结果均符合规定。

3 讨论

吴茱萸产于江西、四川、湖南、湖北、陕西、浙江、广西等地，主产于江西［7-10］。近几年随着市场价格的上涨，主要产区大面积扩种，据统计2017年吴茱萸种植面积达到20万亩，预计2～3年后产量将突破30 000 吨。但由于地理位置、气候条件、栽培条件、采收时间、环境及采收时间等因素而存在品质差异。

通过对收集的吴茱萸药材检测发现，收集的17 批吴茱萸药材杂质、水分、总灰分、二氧化硫、浸出物、柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱总量均符合《中华人民共和国药典》2015 年版规定；17 个批次吴茱萸药材指纹图谱轮廓基本一致，相似度在0.821～0.976之间。进一步结合17批吴茱萸药材的指纹图谱化合计量学分析结果和吴茱萸碱、吴茱萸次碱、柠檬苦素含量测定结果，发现外观为暗黄绿色、成熟度较低的批次中酚酸类及柠檬苦素含量较高，吴茱萸碱和吴茱萸次碱总量较低；而外观为暗黄绿褐色、成熟度较高的批次与之相反，这与此前文献报道的果初期吴茱萸果实中的柠檬苦素含量达到峰值，但随着果实成熟，其含量下降；而吴茱萸碱、吴茱萸次碱在果初期时含量较低，随着果实成熟，逐渐上升至峰值［11-13］，与采收时期密切相关。酚酸类成分属于化感物质，温度、紫外线、光照、雨雾等因素都可以影响酚酸类物质的合成和代谢［14-15］，可能采收中后期开始气候等因素导致吴茱萸果实中酚酸类成分含量下降。因此在吴茱萸药材采收时，应重点关注吴茱萸药材果实的成熟度，控制好采收时期以保证药材质量的均一稳定。