基于生物信息学筛选铁死亡参与溃疡性结肠炎的核心基因及中药治疗预测*

黄晓燕，邹孟龙，陈雅璐，宁 芯，陈柏辉，梁巧俐

1 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023； 2 广西中医药大学研究生学院，广西 南宁 530001

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种慢性复发性直肠及结肠炎症性疾病，临床表现为腹痛、腹泻、便血等［1］。UC的发病机制尚不明确，通常被认为与肠道菌群失调、免疫反应紊乱等密切相关［2］。在临床实践中，常规治疗UC 多使用氨基水杨酸、皮质类固醇、免疫调节剂等药物［1］。然而，长期的西药治疗不仅给患者带来了巨大的经济负担，而且治疗后患者仍有较高的复发［3-4］。因此，探索UC新治疗策略十分有必要。

铁死亡是近年来被新发现的一种细胞程序性死亡，主要病理是脂质活性氧（reactive oxygen species，ROS）和铁离子的积聚导致线粒体体积变小、双层膜更致密、嵴减少及外膜破裂［5-6］。同样地，研究表明铁死亡诱导剂作用于谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4），会使细胞抗氧化能力降低、ROS 堆积，最终引起细胞氧化性死亡［7］。这表明ROS堆积是铁死亡的基本特征。值得提出的是，胃肠道是ROS 产物的主要来源，而肠道黏膜抗氧化剂的含量较少，肠道更容易受到氧化应激的损害［8-9］。与此同时，随着UC的发展，肠道免疫细胞浸润明显增加，诱导了促氧化分子的产生，进而加快ROS堆积［10-11］。总而言之，细胞铁死亡参与了UC的发生发展。

近年来，中医药文化在传承创新中蓬勃发展，同时，生物信息学、网络药理学等工具的出现，为中药的临床运用提供了更有力的证据。因此，不少学者开始探索中药治疗UC 的新策略。WANG等［12］发现莪术苷能下调GPX4 的表达、抑制细胞铁死亡，从而发挥治疗UC 的效用。与西药相比，中药不仅能降低患者的经济负担，而且能从整体上有效治疗UC［13］。基于此，本研究利用生物信息学工具，对UC 患者和健康受试者的结肠组织进行基因表达分析，初步筛选得到与铁死亡相关的UC 差异表达基因，并对相关中药进行预测，旨在为探索治疗UC新策略提供参考。

1 数据库与软件

1.1 数据库GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）；STRING 数 据 库（http：//string-db.org/，Version 11.0）；Coremine 数据库（http：//www.coremine.com/）。

1.2 软件Cytoscape 软件（Version 3.8.0）；R语言（x64 4.0.3）；Perl语言（Strawberry 5.32）。

2 方法

2.1 研究方案利用GEO 数据库筛选UC 差异表达基因；通过常用的中文及英文数据库检索铁死亡相关基因，然后绘制UC 差异基因与铁死亡相关基因的Venn图，取得交集基因。通过STRING数据库对交集基因进行蛋白相互作用分析（proteinprotein interaction，PPI）；借助Coremine 数据库预测潜在治疗中药，筛选出具有调控细胞铁死亡防治UC 效用的中药，最后对得到的中药进行归纳。方案流程见图1。

图1 研究方案流程

2.2 UC 差异表达基因的筛选以“溃疡性结肠炎”的英文“ulcerative colitis”为关键词在GEO 数据中检索，经阅读后筛选并下载编号GSE38713 的芯片数据。该芯片数据包含28 例患者基因表达信息，见表1。

表1 UC样本信息

2.3 铁死亡相关基因以“铁死亡”为关键词，在中国知网数据库、重庆维普数据库及万方数据库中检索，同时以“铁死亡”的英文“ferroptosis”为关键词，在PubMed、Embase 及Cochrane library数据库中检索，综合得到铁死亡相关基因。

2.4 UC 与铁死亡的交集基因将“2.2”项得到的UC 差异表达基因与“2.3”项得到的铁死亡相关基因进行映射取交集，绘制Venn图。

2.5 PPI 网络构建将“2.4”项得到的交集基因导入STRING 数据库，构建PPI 网络，初步预测与UC相关的核心铁死亡基因。

2.6 中药治疗预测将交集基因导入Coremine数据库，映射出相关中药，设置P＜0.01 为阈值，筛选出具有调控细胞铁死亡、防治UC 效用的中药，并对预测中药进行归经、功效归纳。

3 结果

3.1 铁死亡相关基因经检索，共得到60 个与铁死亡相关基因［6，14-16］，见表2。

表2 铁死亡相关基因

3.2 UC 差异表达基因的筛选利用R 语言对GSE38713 芯片数据进行整理，将筛选条件设置为|log FC|≥1 且P＜0.05，对健康受试者和UC 患者的结肠组织基因表达进行分析，共获得差异表达基因1355 个。其中在UC 患者结肠组织中上调基因796 个，下调基因559 个，绘制火山图对数据进行可视化，见图2，横坐标表示log FC，纵坐标表示-log10（PValue），圆点表示基因，绿色圆点表示在UC患者结肠组织中下调的基因，红色表示在UC患者结肠组织中上调的基因，黑色表示无明显差异的基因；并对差异倍数最大的前10 个基因绘制热图，见图3（其中每1 列表示1 个样本，下方为样本名称，上方蓝色表示健康受试者，粉色表示UC患者；每1行表示1个基因在不同样本的差异，红色表示上调基因，绿色表示下调基因，黑色表示无明显差异基因；左侧连线表示差异基因的聚类模式）。

图2 差异表达基因火山图

图3 差异倍数排名前10的基因热图

3.3 UC 与铁死亡的交集基因将筛选得到的1355 个UC 差异表达基因与60 个铁死亡相关基因进行映射，得到8个交集基因，见图4及表3。

表3 UC与铁死亡的交集基因

图4 Venn图

3.4 PPI 网络的构建及可视化分析将交集基因导入STRING 数据库，物种选择人类，最低置信度设为0.04，构建PPI 网络。由图5 可知，CD44 可能是细胞铁死亡干预UC进展的核心基因。

图5 PPI图

3.5 中药治疗预测设置P＜0.01 为筛选标准，通过Coremine 数据库预测具有潜在调控细胞铁死亡防治UC 效用的中药，除ACSF2 映射不出相关中药外，其余7 个基因均可映射出相关中药，共得到69 味中药。将结果导入Cytoscape软件进行可视化分析，见图6。该网络中黄芩、三百草、牡丹皮、人参、生姜、干姜、五味子、丹参、木香、三七的度值较高，提示与调控细胞铁死亡防治UC 的关系最密切。将预测得到的中药进行归经、功效归纳，如图7—8 所示。与UC 铁死亡相关中药多归脾经、胃经，且多属于清热、补虚、活血类。

图6 预测中药可视化

图7 中药归经

图8 中药功效

4 讨论

铁死亡是在研究小分子爱拉斯汀（erastin）杀死含有致癌基因RAS 突变的肿瘤细胞的作用机制时被发现的［14-17］。尽管铁死亡最早是在癌细胞中被发现，但其已被证明对多种系统疾病具有重要意义，例如神经系统疾病［18］、泌尿系统疾病［19］、心血管疾病［20］等。值得提出的是，在铁死亡尚未被发现时，已有许多研究表明，铁离子和ROS 可以通过肠道黏膜影响UC 的发生发展［21-22］。然而，铁离子和ROS损伤机制尚未十分明确。XU等［23］研究发现，在人类UC和UC模型小鼠中均可以观察到结肠黏膜中线粒体萎缩、细胞死亡增加、铁及ROS 被上调，与铁离子转运相关的基因转录也明显增加；表明铁死亡通过内质网应激介导肠上皮细胞死亡，从而促进UC的发展。

本研究通过对健康受试者和UC患者的结肠组织基因表达进行差异分析，共获得差异表达基因1355个，其中上调基因796个，下调基因559个。经过检索常用的中文和英文数据库，获得60个铁死亡相关基因；与铁死亡相关的UC 差异表达基因共8个，分别是CD44、DPP4、LPCAT3、PTGS2、SLC7A11、ABCC1、HMOX1、ACSF2，其中CD44 在PPI 网络中度值最高，表明其可能是铁死亡参与UC 的核心基因。CD44又称人类白细胞黏附分子，是一种跨膜受体糖蛋白，介导细胞-细胞、细胞-基质间的相互作用，参与了细胞增殖、迁移、血管生成等［24］。在UC的进展中，CD44作为潜在的协调刺激分子，招募免疫细胞的聚集、参与T细胞的活化介导慢性炎症的持续发生［25］。对于铁死亡而言，GPX4是介导的关键蛋白。值得思考的是，GPX4活性的抑制不仅是由于ROS来源增多而导致，细胞不能正常催化ROS也可能是导致代谢障碍的原因［5］。亚单元SLC7A11的表达下调导致胞内胱氨酸水平的降低，谷胱甘肽生物合成的缺失，间接导致GPX4的活性被抑制，进而激活铁死亡［26］。LIU 等［27］研究表明，CD44 通过干预亚单元SLC7A11的稳定性，从而调控细胞铁死亡。

UC属于中医学“痢疾”等范畴。根据中医诊疗专家共识［28］，UC多因虚实夹杂导致，系由脾胃虚弱，运化失司，水湿内停，瘀血阻滞，日久化而为热、为火，湿热内生而成痢疾。本研究预测的中药多归脾经、胃经，药物功效多属于清热类、补虚类、活血类，这进一步说明了此次研究结果符合UC的中医病机。通过软件对预测得到的中药进行拓扑分析，发现黄芩、三百草、牡丹皮、人参、生姜、干姜、五味子、丹参、木香、三七等中药在调控细胞铁死亡防治UC的过程中处于核心地位。黄芩归心、肺、胆、大肠经，具有清热、泻火、祛湿、解毒等功效，常被用于治疗湿热泻痢。徐薇涵等［29］研究表明，黄芩素通过调控热休克蛋白70参与结肠黏膜上皮细胞的修复、机体免疫功能的调节，在治疗UC中发挥抗炎作用。人参、生姜、干姜均具有健脾功效，用四君子汤治疗UC亦收获良效［30］。牡丹皮、丹参、三七均具有活血功效。便血是活动性UC患者的常见并发症。别彩娟［31］以芪仙汤治疗UC，有效率高达96.77%。本研究预测的中药多属于清热类、补虚类、活血类，这不仅与UC的中医病机高度符合，而且不少研究也表明以清热法、补虚法、活血法治疗UC可收获良效。

综上所述，本研究通过生物信息学筛选铁死亡参与UC的核心基因，为探索UC新治疗策略提供方向。本研究通过Coremine 数据库筛选具有调控细胞铁死亡防治UC效用的中药，为探索UC新治疗策略提供选择。但本研究存在一定的局限性：1）样本量有限，可能存在基因表达偏倚；2）可能将生理性差异基因纳入病理性差异基因；3）铁死亡相关基因是课题组检索获得，可能存在遗漏，且目前关于铁死亡基因的研究较少，这同样可能存在偏倚；4）通过Coremine 数据库预测潜在的治疗中药，但部分中药在UC中缺乏实验研究证实。