董氏奇穴联合丁沉扶正汤改善胃癌术后患者肠道菌群紊乱的作用机制研究*

张 静，高晓杰，富颖超，韩 玫，邓力威，陈 娟

1 河北省退役军人总医院，河北 邢台 054000； 2 邢台市中医院，河北 邢台 054001

胃癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一，统计结果表明2018 年内结肠原发性肿瘤患者中胃癌的死亡率为8.2%，排名所有肿瘤的第二［1］。手术是胃癌的主要治疗方法之一，但是由于肿瘤患者本身存在免疫抑制，并且麻醉、手术也会影响患者的免疫情况，这会严重影响术后恢复［2］。研究表明，胃癌术后患者肠内微生物会异常繁殖，甚至侵入肠外组织，不但影响患者胃肠功能，甚至会导致全身性炎症反应，影响患者预后［3］。环芳香烃受体（cyclic aromatic hydrocarbon receptor，AhR）的表达受到肠道细菌的激活，可促进白细胞介素22（interleukin-22，IL-22）/信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的信号转导，促进肠黏膜组织的修复，阻止细菌入侵，调节机体的免疫炎症反应［4］。近年来，针药联合的方法在调节免疫和辅助治疗癌症中取得了重大进展。董氏奇穴针灸手法，来自《董氏奇穴针灸学》，其理论基于“穴位空间论”和“奇正接轨论”。研究显示，以董氏奇穴为基础的针药联合不但具有调节免疫的作用［5］，还可以有效提高胃肠道功能［6］。研究显示，扶正汤可以提高晚期胃癌患者的免疫能力，并具有缓解化疗副作用的功能［7］。但是两者联合是否可以改善胃癌术后患者的免疫水平尚不清楚。因此，本文主要基于AhR/IL-22/STAT3 途径探讨董氏奇穴联合丁沉扶正汤对胃癌患者术后免疫水平及肠道菌群的影响，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 临床资料选择2017 年6 月至2019 年6 月在河北省退役军人总医院进行胃癌手术的患者120 例，将以上患者随机分为对照组和针药联合组，每组60 例。对照组中男35 例，女25 例；平均年龄（53.92±4.94）岁；TNM 分期：Ⅰ期14 例，Ⅱ期31 例，Ⅲ期15 例。针药联合组中男37 例，女23例；平均年龄（55.52±5.10 岁；TNM 分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期33例，Ⅲ期15例。两组患者性别、年龄等基线资料比较，差异无统计学意义（P＜0.05），具有可比性。

1.2 纳入标准纳入：1）符合腹腔镜下胃癌根治术手术标准者［8］；2）病理学活检确诊为胃癌者；3）年龄40～70 岁者；4）本研究符合赫尔辛基宣言，所有患者均知情同意，并经医院伦理委员会批准（伦理批件号：第2017-053号）。

1.3 排除标准排除：1）接受化疗、放疗者；2）合并其他恶性肿瘤者；3）合并高血压、糖尿病及血液学疾病和其他消化道疾病者。

1.4 治疗方法两组患者均行腹腔镜下胃癌根治术。1）对照组给予针刺治疗：根据董氏奇穴原理，取土水穴，四花上、中、下三穴，天皇、人皇、地皇三穴，门金上、下二穴，灵骨、大白穴，以此为基础组穴，随证加减。直刺0.5～1 寸，轻提捻转至患者出现麻胀感，留针30 min，每日1次。2）针药联合组在对照组的基础上给予丁沉扶正汤治疗，药物组成：太子参30 g，沉香30 g，乌药30 g，丁香30 g，槟榔30 g，陈皮15 g，半夏15 g，茯苓15 g，苏叶10 g，生姜10 g，大枣10 g，炙甘草10 g。水煎分两次服用。两组均连续治疗7天。

1.5 观察指标

1.5.1 术中指标 比较两组术中基本指标：手术时间、术中出血量及清扫淋巴结数目。

1.5.2 肠道菌群 分别收集术后患者首次排便和干预后粪便样本0.5 g，立即使用无菌水稀释，利用半自动微生物鉴定仪（ATB，梅里埃公司，法国）分析细菌含量，单位为l g/g。

1.5.3 T淋巴细胞亚群水平 在术后第2天和干预后收集患者外周血15 mL，其中10 mL 通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚群水平。通过FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson 公司）测定CD3+、CD4+、CD8+细胞的百分比。

1.5.4 血清指标 将“1.5.3”项下收集的血液样本静置后离心，应用ELISA（Abcam 公司，美国）试剂盒检测血清中D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）、降钙素原、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平，根据试剂盒说明书分别加入抗体和显色剂，然后在450 nm 处检测吸光度值。根据标准曲线计算浓度。

1.5.5 RT-qPCR 检测AhR、IL-22 和STAT3 mRNA表达水平 分别在手术时和术后7 天通过肠镜收集结肠黏膜组织，通过TRIzol（Sigma 公司，USA）从组织中提取总RNA，并检测其纯度。对收集的RNA 进行反转录，试剂盒为PrimeScript-RT 试剂盒（Takara 公司，日本），条件为42 ℃/60 min，70 ℃/5 min，4 ℃下保存，然后利用SYBR Premix Ex Taq™试剂盒（Takara 公司，日本）进行qPCR实验，95 ℃/10 min，94 ℃/15 s，60 ℃/1 min，4 ℃下保存。使用GAPDH 作为内参，通过2-ΔΔCq分析AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.5.6 Western blot 检测AhR、IL-22 和STAT3蛋白表达水平 将“1.5.5”项中的结肠黏膜组织样本研磨萃取总蛋白，通过BCA试剂盒测量浓度。分别取总量为40 µg 的总蛋白使用10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳（80～120 V，90 min）。在100 mV的恒定电压下与PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）进行湿转移。在5%牛血清白蛋白中于室温孵育1 h。将1∶500 稀释的anti-AhR、anti-IL-22 和anti-STAT3（Abcam 公司，美国）添加到分离的蛋白质中，并在4 ℃下孵育过夜。洗涤后在室温下添加HRP 标志的二抗孵育1 h。然后加入化学发光试剂进行显影。GAPDH 用作内参，用Image J 软件分析目标条带的灰度值。

1.5.7 患者恢复情况 统计每位患者的住院时间及并发症发生情况。

1.6 统计学方法本研究的数据分析采用SPSS 19.0 进行，计量资料以±s表示，采用t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 手术指标两组手术时间、出血量及清扫淋巴结数目比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组手术指标比较（±s）

表2 两组手术指标比较（±s）

组别对照组针药联合组例数60 60 t P手术时间（min）95.25±18.57 97.71±19.34 0.724 0.419出血量（mL）89.75±14.38 87.16±15.42 0.683 0.497清扫淋巴结数目（枚）19.76±2.13 19.15±2.26 0.248 0.841

2.2 肠道菌群两组干预前肠道各种菌群含量比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；干预后两组乳酸杆菌和双歧杆菌含量均升高（P＜0.05），且针药联合组高于对照组（P＜0.05）；干预后两组大肠杆菌、梭菌、拟杆菌和柔嫩梭菌水平均降低（P＜0.05），且针药联合组低于对照组（P＜0.05）。见表3。

表3 两组干预前后肠道菌群水平比较

2.3 T 淋巴细胞亚群水平两组干预前外周血T细胞亚群水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；干预后两组CD3+和CD4+细胞比例及CD4+/CD8+比值均较干预前升高（P＜0.05），且针药联合组高于对照组（P＜0.05）。见表4。

表4 两组干预前后T细胞亚群水平比较

2.4 外周血D-LA 和炎性因子水平两组干预前血清D-LA 和炎性因子水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；干预后两组各项指标均较干预前降低（P＜0.05），且针药联合组各项指标均低于对照组（P＜0.05）。见表5。

表5 两组干预前后外周血D-LA和炎性因子水平比较

2.5 AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 及 蛋 白 表 达水平两组干预前结肠黏膜组织中AhR、IL-22 和STAT3 mRNA 及蛋白表达水平比较，差异有统计学（P＜0.05）；干预后两组各项指标均较干预前升高，其中针药联合组各项指标高于对照组（P＜0.05）。见表6、图1。

图1 两组肠黏膜AhR/IL-22/STAT3中蛋白表达水平

表6 两组术后及干预后AhR、IL-22和STAT3 mRNA及蛋白表达水平比较（±s）

表6 两组术后及干预后AhR、IL-22和STAT3 mRNA及蛋白表达水平比较（±s）

注：a表示与本组术后比较，P＜0.05

组别对照组针药联合组例数60 60干预后4.21±0.40 a 5.68±0.53 a 18.647 0.000干预后4.08±0.38 a 5.54±0.51 a 19.524 0.000 P组别对照组针药联合组IL-22 mRNA术后2.69±0.24 2.55±0.23 0.753 0.438 IL-22 蛋白术后1.41±0.13 1.29±0.12 0.834 0.312 t例数60 60干预后4.34±0.41 a 6.04±0.56 a 21.953 0.000干预后2.46±0.22 a 3.38±0.31 a 14.723 0.000 AhR mRNA术后2.75±0.24 2.63±0.25 0.612 0.463 AhR蛋白术后1.32±0.12 1.41±0.15 0.686 0.475 t P干预后2.06±0.19 a 3.19±0.30a 14.864 0.000干预后2.27±0.23 a 3.08±0.30 a 11.806 0.000 STAT3 mRNA术后2.78±0.26 2.92±0.27 0.343 0.662 STAT3蛋白术后1.56±0.15 1.50±0.14 0.275 0.714

2.6 并发症发生情况及住院时间针药联合组术后发生切口感染1 例，腹腔感染1 例，并发症发病率3.33%（2/60）；对照组术后发生切口感染3例，腹腔感染3 例，肺部感染2 例，并发症发病率13.33%（8/60）。两组比较，差异有统计学意义（χ2=3.927，P=0.048）。住院时间针药联合组为（11.28±2.17）天，对照组为（16.75±2.48）天，针 药联合组短于对照组（t=50812，P=0.000）。

3 讨论

腹腔镜下行胃癌根治术是治疗非转移性胃癌的重要方法，但是研究显示麻醉过程、手术过程均会引起患者的应激反应，这会提高炎性水平抑制免疫能力。研究证实，接受胃癌根治术的患者在术后会出现肠道功能紊乱和免疫水平降低，这会引起细菌过度繁殖和肠道黏膜损伤，进而使肠道内的微生物和内毒素通过肠黏膜侵入肠外组织，影响术后康复［9］。

大量临床证据表明，中医中药可以辅助治疗癌症和提高机体免疫能力。本研究结果显示，针药联合可以明显促进术后肠道有益菌（乳酸菌和双歧杆菌）的恢复，减少大肠杆菌等有害菌的繁殖，提高外周血中CD3+、CD4+及CD4+/CD8+的水平。临床证实针刺治疗可以促进胃癌术后胃肠蠕动、促进肠道积气排出，加快恢复消化道的正常功能［10］。本研究研究了相关的科研、文献材料及书籍，从中国传统医学角度出发，根据中医理论，术后耗气伤血、正气亏虚，气虚则运行无力，滞于胃肠，导致胃癌术后消化道功能紊乱。据此，本研究组建中药组方丁沉扶正汤，配合董氏奇穴益气健脾，和胃降逆，从根本上缩短胃癌术后消化道功能紊乱的病程［11］。丁沉扶正汤不但可以抑制肿瘤组织中原癌基因的表达，还可以促进巨噬细胞功能提高免疫能力［12］。陆洁等［13］研究显示，扶正汤可以缓解晚期胃癌患者的免疫抑制情况并延长患者生存期。针药联合可以协同作用，激发中药药性，进一步提高治疗效果。研究表明，在扶正汤的基础上联合针灸可以促进中药的治疗效果［14］。

董氏奇穴是一种传统的针刺手法，其针药联合可以进一步调控免疫［15］。本研究结果显示，董氏奇穴联合丁沉扶正汤可以共同提高消化道功能，调节肠道菌群，进而阻止D-LA 等入侵，缓解炎性反应并调节免疫反应，抑制肠道有害菌的过度繁殖，进而促进胃癌患者术后恢复。

肠黏膜是阻止大肠杆菌及其分泌的D-乳酸等入侵的关键屏障。研究显示，麻醉和胃癌手术均会引起肠黏膜受损，从而影响胃癌患者的预后［16-17］。AhR表达于肠黏膜上皮组织，肠道菌群的失调会影响AhR 的表达，进而抑制IL-22 的水平。IL-22会激活STAT3并促进其核转位，进而促进细胞增殖相关基因的转录水平，使肠黏膜细胞增殖促进肠黏膜组织的修复［18］。而肠黏膜组织的修复会使机体的免疫水平恢复，进而反过来调控肠道菌群［19］。本研究结果显示，在术后的恢复过程中，AhR/IL-22/STAT3 转录和翻译的水平升高，而针药联合可以进一步促进肠黏膜组织表达AhR、IL-22和STAT3 mRNA 和蛋白，进而促进肠黏膜屏障恢复。研究显示，黄芪中的活性单体黄芪甲苷Ⅳ可通过抑制NLRP3 炎症小体信号传导缓解败血症诱导的肠屏障功能障碍［20］。体内研究显示，党参可以促进肠黏膜功能的恢复［21-22］。本研究结果显示，董氏奇穴联合丁沉扶正汤可通过促进AhR/IL-22/STAT3 通路转录和翻译的水平促进肠黏膜的修复，进而阻止D-LA 等入侵，缓解炎性反应并调节免疫反应，抑制肠道有害菌的过度繁殖，进而促进胃癌患者术后恢复。

综上所述，董氏奇穴联合丁沉扶正汤可能通过促进AhR/IL-22/STAT3 通路保护肠黏膜屏障，进而促进胃癌患者术后的细胞免疫缓解肠道菌群失衡，促进患者恢复。但是关于奇穴联合丁沉扶正汤提高胃癌患者术后恢复以及调控AhR/IL-22/STAT3通路的分子机制仍需要进一步研究。