基于网络药理学探讨真武汤合葶苈大枣泻肺汤治疗急性心力衰竭的作用机制*

张和针，刘培中，赖天伟，刘 思，艾长江

广东省中医院珠海医院，广东 珠海 519000

急性心力衰竭是各种心脏疾病进展出现严重临床症状或晚期阶段，死亡率和再住院率显著升高。发达国家的心衰发病率为1.5%～2.0%，70 岁以上人群发病率≥10%［1］。2003年流行病学调查显示，我国35～74 岁成年人中心力衰竭发病率为0.9%［2］。目前，急性心力衰竭及基于慢性心力衰竭的急性发作是全世界主要的公共疾病问题之一。流行病学调查显示，目前不断升高的医疗水平使患心脏疾病患者生存期延长，一定程度上致使我国心衰发病率呈持续升高趋势［3］。与治疗慢性心力衰竭相比，治疗急性心力衰竭的药物研究近几十年来无较大进展，而改善症状、稳定血流动力学状态，可以争取更多治疗时间，让医生能更充分予患者综合性治疗，有利于改善患者生活质量及远期预后。

《黄帝内经》论述心力衰竭的病因病机比较复杂，时令异常可致病，脏腑经脉传变、饮食不节、七情内伤、气血失调亦可致病。《伤寒杂病论》认为，心衰与少阴相关（指足少阴肾与手少阴心），与气化不利、心肾阳虚、水液不化、凌心射肺以及气虚血瘀、血不利则为水等有关。现代各名医大家对于心衰病因病机的认知已基本形成共识［4］，大多认为心衰病位在心，五脏相关，为本虚标实之证，以气虚、阳虚、阴虚为本虚，水停、血瘀、痰饮为标实。

真武汤与葶苈大枣泻肺汤两方都来源于《伤寒杂病论》，其曰：“太阳病……其人仍发热，振振欲……真武汤主之”“肺痈胸满胀……喘鸣迫塞，葶苈大枣泻肺汤主之”［5］。此二方均有利水功效，葶苈大枣泻肺汤主要泻心肺、逐水饮，而真武汤为温阳化气利水剂。真武汤合葶苈大枣泻肺汤温阳化气而治本，利水逐饮以治标，标本兼治，诸药合用起温壮心肾之阳气、利水消肿，共奏温阳化气利水之功效。药理学研究表明，真武汤方中附子、白术、茯苓均有利尿作用［6］，其中附子是通过强心、扩血管而利尿；白术是直接作用于电解质的排泄而起利尿作用；茯苓可通过降低抗利尿激素分泌且提高渗透压的调定点而利尿。另外研究表明，真武汤可增强心肌收缩力、减轻前后负荷、改善心脏舒缩功能［7］。葶苈大枣泻肺汤具有强心、减慢心率、增强心肌收缩力、提高衰竭心脏的心输出量、降低静脉压、松弛血管平滑肌、减少肺血管阻力、缩小扩大的心脏等作用［8］。因此，两方并用不仅可改善心衰患者的临床症状、体征，还可扩张血管、改善心肌舒缩功能，对改善心脏功能具有重要价值。

真武汤合葶苈大枣泻肺汤成分复杂，靶点众多，其作用机制尚不明确。因此，本研究通过利用网络药理学方法，建立真武汤合葶苈大枣泻肺汤-急性心力衰竭-靶点互作网络，诠释急性心力衰竭治疗急性心力衰竭的可能作用机制，以期为治疗急性心力衰竭提供新的治疗方法。

1 资料与方法

1.1 真武汤合葶苈大枣泻肺汤成分与潜在靶点筛选本研究采用中药系统药理学分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//tcmspw.com/tcmsp.php）检索附子、生姜、茯苓、白术、白芍、葶苈子、大枣7 味中药的全部化学成分，TCMSP 数据库以化合物口服生物利用度（oral bioactivity，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 作为活性化合物的筛选条件。同时利用中医分子机理生物学信息分析工具（BATMANTCM，http：//bionet.ncpsb.org.cn/batmantcm/）对这7 味药进行检索，检索条件为score cutoff≥20，P-value cutoff＜0.05；检索的化合物成分须符合OB≥30%和类DL≥0.18，得到对应的化合物靶点。将两个数据库的成分预测靶点去重合并，建立真武汤合葶苈大枣泻肺汤化学成分-靶点数据库。

1.2 急性心力衰竭疾病靶点的确定通过药物靶标数据库（Therapeutic Target Database，TTD）（http：//db.idrblab.net/ttd/），比较毒理基因组学数据库（The Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（http：//ctdbase.org/），在线人类孟德尔遗传数据库（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM0）（https：//www.omim.org/）及GenCards（http：//www.genecards.org/）检索与急性心力衰竭相关靶点。将4个数据库的成分预测靶点去重合并，建立急性心力衰竭疾病靶点数据库。

1.3 获取真武汤合葶苈大枣泻肺汤与急性心力衰竭疾病的共同靶点利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）将真武汤合葶苈大枣泻肺汤靶点转换为标化靶点，获得swiss-prot ID，将药物与疾病靶点输入Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）绘制韦恩图，获得共同靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络的构建将真武汤合葶苈大枣泻肺汤-急性心力衰竭疾病共同作用靶点导入STRING（https：//string-db.org/cgi/input.pl）数据库中，以置信度分数score＞0.9 为条件进行筛选，并隐藏网络中无联系的节点，余参数不变，获取真武汤合葶苈大枣泻肺汤-急性心力衰竭疾病PPI网络。

1.5 基因本体(gene ontology，GO)功能与KEGG信号通路富集分析利用David 6.8 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）对真武汤合葶苈大枣泻肺汤和急性心力衰竭疾病共同作用靶点蛋白进行GO 功能和KEGG 通路富集分析。GO 功能分析主要用于描述基因靶点的功能，包括细胞功能、分子功能和生物功能。KEGG 富集分析可以得到真武汤合葶苈大枣泻肺汤和急性心力衰竭疾病共同靶点所富集的信号通路。利用Cytoscape 3.8.2 软件构建“药物-活性化学物质-疾病-作用靶点-作用途径”网络图，药物活性成分、作用靶点、疾病以“节点”表示，节点之间的相互作用以“边”表示。

2 结果

2.1 药物-疾病靶点的获取结果在TCMSP 及BATMAN-TCM 数据库中查询真武汤合葶苈大枣泻肺汤治疗疾病的活性成分作用靶点，根据OB≥30%和DL≥0.18，共获得631个，去除重复靶标后，共获得196个潜在靶标。见表1。

表1 真武汤合葶苈大枣泻肺汤中OB值前10的化合物基本信息

2.2 急性心力衰竭疾病靶点筛选通过在TTD，CTD，OMIM 和GenCards 数据库检索，并结合相关文献，限定Score≥10，共得到与AS 疾病相关人类靶点2271个。

2.3 真武汤合葶苈大枣泻肺汤与急性心力衰竭疾病共同作用靶点预测利用Venny 2.1 绘制韦恩图，筛选出真武汤合葶苈大枣泻肺汤与急性心力衰竭疾病的共同的靶点，得到共同靶点127 个，有HTR3A、MMP2、ACHE、AKR1B1、ADRA2B、ADRA2C、AR、SLPI、BAX、BCL2等。见图1。

图1 真武汤合葶苈大枣泻肺汤与急性心力衰竭疾病靶点的匹配韦恩图

2.4 关键靶点的PPI构建将127个真武汤合葶苈大枣泻肺汤与急性心力衰竭疾病共同靶点的潜在靶点录入STRING数据库中，进行分析得到PPI，见图2A。该网络图共包含127 个节点，394 条边，平均节点度为6.4，平均局部聚类系数为0.45，其中节点表示蛋白，每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多表示关联度越大。导入Cytoscape 软件，利用Cytoscape 中cytoHubba插件，挖掘hub 基因，ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6 为排名前十的基因，这些靶基因可能是PPI 网络中的枢纽节点，也很可能是白芍总苷治疗OLP 的核心靶点，见图2B。

图2 STRING数据库分析蛋白的相互作用

2.5 共同作用靶点的GO富集分析和KEGG通路分析GO 富集分析：P值代表富集的显著性，相应的P值越小，其颜色越偏向红色，反之颜色偏向蓝色；横坐标表示富集数目。提示真武汤合葶苈大枣泻肺汤-急性心力衰竭疾病-基因的生物过程（BP）显著富集在脂多糖、细菌源、金属离子、营养水平、氧自由基、抗生素反应等；分子功能（MF）主要富集在血红素结合、儿茶酚胺结合、四吡咯结合、磷酸酶结合、细胞因子受体结合等。细胞组分（CC）主要富集在膜筏、膜微结构域、膜区域、小凹、质膜筏、囊腔等。见图3A—C。

图3 真武汤合葶苈大枣泻肺汤与急性心力衰竭疾病靶点的生物功能分析

KEGG 富集分析：将得的127 个共作靶点通过DAVID 数据库进行KEGG 通路富集分析，运行后得到147条通路。将通路排名前20位的结果绘制得到条形图，见图4。横坐标表示靶点数，纵坐标表示通路名称，颜色表示P值，P值越小颜色越偏向红色，P值越大则越偏向蓝色。结果显示，真武汤合葶苈大枣泻肺汤治疗急性心力衰竭疾病靶点主要富集的是AGE-RAGE 糖尿病并发症中的信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流体剪切应力和动脉粥样硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、TLR 信号通路（toll-like receptor signaling pathway）等，提示真武汤合葶苈大枣泻肺汤治疗急性心力衰竭疾病可能通过以上多条信号通路起到协同作用。

图4 真武汤合葶苈大枣泻肺汤治疗急性心力衰竭的KEGG富集分析

2.6 真武汤合葶苈大枣泻肺汤-成分-作用靶点-通路-急性心力衰竭疾病网络构建采用Cytoscape软件构建真武汤合葶苈大枣泻肺汤-成分-作用靶点-通路-急性心力衰竭疾病的网络模型。其中黄色菱形节点代表疾病、红色菱形节点代表药物、粉红色椭圆形节点代表成分，蓝色长方形节点代表共同作用靶点，黄色三角形代表KEGG，绿色椭圆形代表通路，边代表相互作用关系。其中檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍药苷、β-胡萝卜素、光千金藤碱能与60 个以上靶点相连接，推测这6 个成分是真武汤合葶苈大枣泻肺汤中多靶点治疗急性心力衰竭疾病的主要活性成分。ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6 这些靶点可能在急性心力衰竭疾病治疗中发挥重要的作用。以上结果可以得出真武汤合葶苈大枣泻肺汤的各个成分通过多靶点、多信号通路来治疗急性心力衰竭疾病。见图5。

图5 中药-成分-潜在性靶标-通路-疾病网络图

3 讨论

急性心力衰竭发作时，以稳定血流动力学、纠正低氧，维护各脏器灌注和功能、治疗急性心力衰竭的病因和诱因、预防血栓栓塞等为治疗目标。前期临床研究提示，真武汤合葶苈大枣泻肺汤可在西医基础治疗上进一步提高阳虚水泛型急性心力衰竭患者的治疗作用。目前真武汤合葶苈大枣泻肺汤药效物质基础和作用机制不十分明确。

本研究结果显示，通过TCMSP 数据库共筛选出真武汤合葶苈大枣泻肺汤活性成分主要有檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍药苷、β-胡萝卜素、光千金藤碱等。山柰酚（kaempferol）属于黄酮类化合物，主要来源于姜科植物山柰的根茎，又名山柰黄酮醇、山柰素、四羟基黄酮、山柰酚-3 等，具有抗癌、防癌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎等多种作用［9-10］。槲皮素是一种黄酮类化合物，具有很强的生物活性，可通过减少氧化应激、干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统和下调活性氧介导的下游信号通路等方式，发挥抗氧化、抗肿瘤、抗炎症、抗菌和保护心血管等药理作用［11］。提示这些活性成分在治疗急性心力衰竭疾病中发挥着显著效果。这与目前基础研究的结果相同，证实了本研究预测结果的可靠性。

通过STRING 数据库构建靶点交互作用网络，分析得到排名前10 位的靶点有ESR1、AKT1、JUN、MYC、MAPK1、MAPK14、CXCL8、FOS、IL-1B、IL-6，提示这些靶点可能是治疗急性心力衰竭中的重要靶点。E2通过膜ESR 而与胞内信号转导蛋白发生作用，它发挥心血管保护作用是由ESR1 非转录途径介导的，可以活化内皮细胞中的一氧化氮合酶［12］。AKT1 作用通道调控细胞增殖和生长，参与包括细胞凋亡和葡萄糖代谢在内的细胞过程。JUN 是重要的丝裂原活化蛋白激酶，是把细胞外信号转到细胞内的关键酶，参与细胞的生长、发育、分裂、死亡等多种生理反应过程［13］。缺氧可导致动脉血管内皮细胞损伤有关的基因的表达水平发生变化，通过下调缺氧条件下细胞中FOS 基因的表达，可以抑制NR4A1基因，并降低由于缺氧升高的p38的磷酸化，从而起到减轻动脉血管内皮细胞损伤的作用［14］。综上所述，真武汤合葶苈大枣泻肺汤可能通过调节上述基因靶点的表达，减轻由其引发的细胞凋亡、细胞代谢、炎症反应，从而延缓急性心力衰竭进展。

GO 功能富集分析显示，关键靶点的生物过程显著富集在脂多糖、细菌源、金属离子、营养水平、氧自由基、抗生素反应等；分子功能主要富集在血红素结合、儿茶酚胺结合、四吡咯结合、磷酸酶结合、细胞因子受体结合等。细胞组分主要富集在膜筏、膜微结构域。这些生物学功能在上述活性成分及关键靶点涉及的通路都有所体现。

KEGG 通路富集结果提示，真武汤合葶苈大枣泻肺汤可能是AGE-RAGE 糖尿病并发症中的信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、IL-17 信号通路、TLR 信号通路，起到治疗急性心力衰竭的作用。AGEs-RAGE 信号通路激活NF-κB，可引起大量黏附分子、生长因子、促炎细胞因子（如白细胞介素6、白细胞介素8、肿瘤坏死因子α）等的表达和释放，最终引起慢性细胞活化和组织损伤［15］。糖尿病并发症AGE-RAGE途径与心肾综合征发病密切相关［16］。晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）与不同组织RAGE 受体结合会诱发炎症反应、内皮功能障碍等，是心肾综合征主要发病机制之一［17］。AGEs 水平增高是急性心力衰竭患者死亡的独立危险因素［18］。IL-17 信号通路一是具有聚集和激活中性粒细胞、单核细胞等炎症细胞的功能；二是通过核因子κB 途径促进多种炎症递质的释放，从而放大炎症反应，加重组织损伤［19］。TNF 信号通路不仅与炎症、凋亡密切相关，而且其与PI3K-Akt 信号通路间的交叉作用参与细胞周期调节［20］。可见真武汤合葶苈大枣汤中的活性成分对急性心力衰竭的生物过程及多条信号通路具有调控作用。

多项研究提示，网络药理学研究可以阐明中药“多成分-多靶标”的作用特点。本研究经过网络药理学分析预测发现，真武汤合葶苈大枣泻肺汤通过主要活性化合物檞皮素、β-谷固醇、山柰酚、芍药苷等的靶标调节机制和AGE-RAGE、IL-17等信号通路，发挥治疗急性心力衰竭的作用，这为更深入探讨其作用机制提供了新方向，但仍需更多的实验及临床研究进行验证。