霍山石斛减轻高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝损伤

刘 冬 刘 莹 韩 松 韩吉春

1 滨洲医学院 山东 烟台 264003; 2 龙口市妇幼保健院 山东 烟台 265701;3 安徽斛生记生物科技有限公司 安徽 合肥 230088

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精外的其他因素造成的肝脏损伤,按照病理进程可分为:单纯性脂肪肝(simple fatty liver,SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)和肝硬化[1]。NAFLD的发病率极高,全球的发病率约为25%,而我国的NAFLD的发病率更是高达29.2%[2]。目前,市面上并没有用于专门治疗非酒精性脂肪性肝病的药物,临床主要使用一些降脂药物来治疗非酒精性脂肪性肝病,如他汀类降血脂药物,这种无药可用的情况严重阻碍了非酒精性脂肪性肝病的治疗[3]。因此,寻找一种安全、有效和低毒的药物来治疗非酒精性脂肪性肝病是迫切需要的。

高脂饮食被认为是诱发非酒精性脂肪性肝病的主要原因之一,长期的高脂饮食会造成血脂水平升高,并在肝脏部位发生严重的脂质蓄积,最后诱发非酒精性脂肪性肝病的发生[4-5]。也有研究发现,非酒精性脂肪性肝病患者的肝脏存在着炎症反应,这又诱发了炎症损伤,进一步加重了非酒精性脂肪性肝病损伤[6-7]。因此,寻找一种降脂和抗炎作用的药物来治疗非酒精性脂肪性肝病可能是一条有效的策略。

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.TangetS.J.Cheng)是我国特有的一种中草药,具有多种生物学活性,如抗氧化和抗炎等[8-9]。本研究前期研究发现霍山石斛具有很好的降脂作用[8-9],但是关于霍山石斛治疗非酒精性脂肪性肝病的研究尚未报道。因此,本研究旨在研究霍山石斛治疗非酒精性脂肪性肝病的药效。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物 SPF级成年雄性C57BL/6小鼠,体重(20±2)g,购自济南市金丰实验动物繁育有限公司,实验动物生产许可证号:SCXK(鲁)2014-0006。

1.2 实验试剂 霍山石斛由安徽斛生记生物科技有限公司提供。肿瘤坏死因子ɑ(Tumor necrosis factor-α,TNF-ɑ)、白介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)、白介素6(Interleukin 6,IL-6)、谷草转氨酶(Glutamic transaminase,AST)、谷丙转氨酶(Glutamic-pyruvic transaminase,ALT)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、血清总胆固醇(Total serum cholesterol,TC)和低密度脂蛋白胆固醇(Low-Density Lipoprotein Cholesterol,LDL-C)试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。CD68一抗购自abcam公司。其它试剂皆为国产,纯度为分析纯。

1.3 霍山石斛水提取物的制备 采用粉碎机对干品霍山石斛茎部进行粉碎。取霍山石斛粉末20 g,加入500 mL蒸馏水回流提取,每次提取1 h,重复2次。提取后合并水提液,用200目滤布过滤。水提液旋转蒸发仪浓缩至100 mL。将浓缩液冷冻干燥成粉末,称重。最终获得5.37 g粉末,提取率为26.85%。将所得霍山石斛水提取物粉末低温保存备用。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组与给药处理 50只成年雄性C57BL/6小鼠被随机分为5组:正常组、非酒精性脂肪肝模型组、0.1 mg/kg霍山石斛组、1 mg/kg霍山石斛组和10 mg/kg霍山石斛组。正常组:喂食正常基础饲料12周,并在第5周开始每天灌胃1 mL蒸馏水。非酒精性脂肪肝模型组:喂食高脂高糖饲料(每100 g高脂高糖饲料成分:72 g正常基础饲料、10 g猪油、3 g胆固醇、10 g蔗糖、5 g 蛋白粉和2 g丙基硫氧嘧啶)12周,并在第5周开始每天灌胃1 mL蒸馏水。0.1 mg/kg霍山石斛组:喂食高脂高糖饲料12周,并在第5周开始每天灌胃0.1 mg/kg霍山石斛水提取物。1 mg/kg霍山石斛组:喂食高脂高糖饲料12周,并在第5周开始每天灌胃1 mg/kg 霍山石斛水提取物。10 mg/kg霍山石斛组:喂食高脂高糖饲料12周,并在第5周开始每天灌胃10 mg/kg霍山石斛水提取物。

1.4.2 生化指标检测 喂养12周后,通过小鼠眼球取血1 mL,室温下静置2 h后,离心(3 500rpm) 10 min,收集并分装好血清,存放与-20 ℃备用。严格按照AST、LDL-C、TNF-ɑ、ALT、IL-1β、TC、IL-6和TG的试剂盒说明,检测血清中AST、ALT、TG、TC、HDL、TNF-ɑ、IL-1β和IL-6的含量。

1.4.3 HE染色切片观察 取血后,颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠,摘取肝脏,使用预冷的生理盐水进行洗涤,并使用滤纸吸干肝脏上的水分后,使用4%中性甲醛进行固定。HE 染色切片,病理学观察每组切片中炎症细胞及组织坏死程度。HE染色实验步骤:①石蜡切片脱蜡至水:依次将切片放入二甲苯Ⅰ 20 min-二甲苯Ⅱ 20 min-无水乙醇Ⅰ 10 min-无水乙醇Ⅱ 10 min-95%酒精5 min-90%酒精5 min-80%酒精5 min-70%酒精5 min-蒸馏水洗。②苏木素染细胞核:切片放入Harris苏木素染3～8 min,自来水洗,1%的盐酸酒精分化数秒,自来水冲洗,0.6%氨水返蓝,流水冲洗。③伊红染细胞质:切片放入伊红染液中染色1～3 min。④脱水封片:将切片依次放入95%酒精I 5 min-95%酒精II 5 min-无水乙醇Ⅰ 5 min-无水乙醇Ⅱ 5 min-二甲苯Ⅰ 5 min-二甲苯Ⅱ 5 min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。⑤显微镜镜检,图像采集分析。染色结果:细胞核蓝色,细胞质红色。

1.4.4 天狼星红染色 将固定好的石蜡切片进行切片,然后按照以下步骤进行染色。① 石蜡切片脱蜡至水。② 滴加天狼星红染液,37 ℃下孵育1 h后,流水冲洗 30 s。③ 使用苏木精染细胞核8 min后,流水冲洗10 min。④脱水封片。光学显微镜下即可观察肝脏纤维化的情况。

1.4.5 油红O染色 取血后,颈椎脱臼法处死C57BL/6小鼠,马上摘取肝脏,并使用 Leica CM3050 S冰冻切片机对新鲜肝脏组织进行冰冻切片。取出冻存的切片按照以下步骤进行油红O染色:① 室温回温,蒸馏水浸洗,洗掉包埋剂。② 60%异丙醇浸洗2 min。③ 油红O工作液染色4 min。④ 60%异丙醇调色后,水洗。⑤ 苏木精复染。⑥ 盐酸酒精分化,并使用流水进行反蓝。⑦使用明胶封片。光学显微镜下即可观察肝脏脂质蓄积情况。

1.4.6 检测肝脏组织中CD68的表达 将固定好的石蜡切片进行切片,然后按照以下步骤进行染色。① 石蜡切片脱蜡至水。② 使用3% H2O2在37 ℃下孵育5 min后,用双蒸水冲洗,并浸泡在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。③ 将切片放入0.01 mmol/L的枸橼酸钠溶液中,并使用微波进行修复,修复完成后,使用PBS清洗切片3次。④滴加CD68一抗工作液(使用山羊血清稀释抗体,稀释比例为1∶1 000),37 ℃孵育4 h后,用PBS清洗切片3次。⑤ 滴加生物素标记的二抗(使用1%BSA-PBS进行稀释),37 ℃孵育30 min后,使用PBS清洗3次。⑥ 滴加辣根酶标记链霉卵白素,37 ℃孵育30 min后,使用PBS清洗3次。⑦ DAB显色5 min后,自来水冲洗。⑧ 中性树胶封片。光学显微镜下即可观察肝脏组织中CD68的表达情况。

2 结果

2.1 霍山石斛减轻非酒精性脂肪肝损伤 为了解霍山石斛对肝功能指标的影响,本研究检测了各组小鼠血清中AST和ALT的活性。如表1所示,与正常组比较,非酒精性脂肪肝模型组血清中的AST和ALT的含量显著升高(P<0.01),而1 mg/kg和10 mg/kg的霍山石斛均能明显降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中AST和ALT含量(P<0.01)。0.1 mg/kg的霍山石斛并不能有效降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中AST和ALT的含量。

表1 霍山石斛降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中ALT和AST的含量

HE染色结果也同样表明霍山石斛能有效减轻非酒精性脂肪肝损伤。结果如图1所示,正常组小鼠肝脏肝细胞索排列整齐,肝细胞结构清晰,嗜酸性,核大而圆、居中,肝小叶结构清晰,也无脂肪变。非酒精性脂肪肝模型组小鼠肝脏中央静脉周围肝细胞索排列紊乱,胞质内可见大小不等、数量不一的圆形脂肪空泡。0.1 mg/kg霍山石斛组中小鼠肝脏组织与非酒精性脂肪肝模型组一样,出现严重的肝脏损伤,肝中央静脉周围肝细胞索排列紊乱,同样也有大量的脂肪样变空泡。1 mg/kg和10 mg/kg霍山石斛治疗均能不同程度减轻非酒精性脂肪肝病小鼠的肝脏损伤,基本无脂肪空泡,肝细胞结构清晰。

图1 HE染色结果显示霍山石斛减轻非酒精性脂肪肝损伤 (n= 6)

2.2 霍山石斛减轻非酒精性脂肪肝病的肝脏纤维化 结果如图2所示,与正常组比较,非酒精性脂肪肝模型组小鼠肝脏出现严重的肝纤维化。与非酒精性脂肪肝模型组比较,霍山石斛治疗能有效减轻非酒精性脂肪肝小鼠的肝纤维化,并且10 mg/kg的霍山石斛的治疗效果最好。

图2 霍山石斛减轻非酒精性脂肪肝小鼠的肝纤维化 (n= 6)

2.3 霍山石斛改善非酒精性脂肪肝病小鼠的脂质代谢紊乱 血脂检测结果如表2所示,非酒精性脂肪肝模型组小鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量显著升高,与正常组之间具有显著性差异(P<0.05)。与非酒精性脂肪肝模型组比较,1 mg/kg和10 mg/kg的霍山石斛治疗均能有效降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量(P<0.05)。油红O染色结果也同样显示(图3),非酒精性脂肪肝模型组小鼠肝脏组织中出现严重的脂质蓄积。与非酒精性脂肪肝模型组比较,1 mg/kg和10 mg/kg的霍山石斛治疗均能有效减轻非酒精性脂肪肝小鼠肝脏中的脂质蓄积。但是0.1 mg/kg的霍山石斛治疗并不能有效改善非酒精性脂肪肝小鼠的脂质代谢紊乱。

图3 油红O染色结果显示霍山石斛降低非酒精性脂肪肝小鼠肝脏中的脂质蓄积(n= 6)

表2 霍山石斛降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量

2.4 霍山石斛减轻非酒精性脂肪肝小鼠的炎症反应 如表3所示,与正常组比较,非酒精性脂肪肝模型组小鼠血清中的炎症因子(IL-1β、IL-6和TNF-ɑ)的含量显著升高(P<0.01)。与非酒精性脂肪组肝小鼠比较,1 mg/kg和10 mg/kg的霍山石斛均能显著降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中这些炎症因子水平(P<0.01),但是0.1 mg/kg的霍山石斛治疗并不能有效降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中炎症因子水平。通过检测肝脏组织中CD68的表达来分析肝脏组织中巨噬细胞(Kupffer细胞)分布情况。结果如图4所示,与正常组比较,非酒精性脂肪肝模型组小鼠肝脏组织中CD68的表达显著升高。与非酒精性脂肪肝模型组比较,1 mg/kg和10 mg/kg的霍山石斛治疗均能有效降低非酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织中CD68的表达,但是0.1 mg/kg的霍山石斛治疗并不能有效降低非酒精性脂肪肝小鼠肝脏组织中CD68的表达。这些结果均表明,霍山石斛能效减轻非酒精性脂肪肝小鼠的肝脏炎症。

图4 CD68染色结果显示霍山石斛降低非酒精性脂肪肝小鼠CD68阳性标记的Kupffer细胞数(n= 6)

表3 霍山石斛降低非酒精性脂肪肝小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-ɑ的含量

3 讨论

霍山石斛是常用的中药,味甘,性微寒,归胃经、肾经,有益胃生津、滋阴清热的功效,霍山石斛有较好的护肝利胆作用,历代医家都认为霍山石斛具有滋养肝阴的作用,是治疗各种肝胆病的要药,可用于治疗肝炎、胆囊炎、胆结石等肝胆疾病。因此,本研究推测霍山石斛可能具有治疗非酒精性脂肪肝。

高脂饮食被认为是引发非酒精性脂肪肝病的主要原因之一,高脂饮食增加血液中游离脂肪酸的含量,超出了肝脏对游离脂肪酸的代谢,最终导致肝功能受损[10]。目前高脂喂食大鼠或小鼠建立的非酒精性脂肪肝病动物模型也被广泛用于非酒精性脂肪肝病的研究[11]。本研究采用高脂喂食C57BL/6小鼠12周,建立小鼠非酒精性脂肪肝病模型。结果发现,高脂饮食显著增加血清中AST和ALT的水平,并且肝脏组织出现严重的损伤和肝纤维化。通过霍山石斛治疗可以显著降低高脂饮食诱导的AST和ALT升高,同时也显著减轻高脂饮食诱导的肝损伤和肝纤维化。这些结果说明霍山石斛能有效改善高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝损伤。

脂质代谢紊乱被认为是非酒精性脂肪肝病的发病机制之一,高脂饮食会造成能量过剩,引发高血脂,并在肝脏中大量蓄积,造成肝损伤[12-13]。在本研究中,确实发现高脂饮食显著增加小鼠血清中TG、TC和LDL-C的水平,增加肝脏中的脂质蓄积。霍山石斛可以显著改善高脂饮食诱导的血脂紊乱和肝脏脂质蓄积。这些结果表明,霍山石斛对非酒精性脂肪肝病的改善作用可能与其降脂作用有关。

随着对非酒精性脂肪肝病的研究深入,炎症也被认为是引发非酒精性脂肪肝病的主要原因之一[14]。研究表明,肝脏发生脂质蓄积会诱发肝脏炎症,增加机体炎症因子水平,并增加肝脏组织中的巨噬细胞(Kupffer细胞),对肝脏造成炎症损伤[15]。炎症损伤会进一步破坏肝脏对脂质的代谢能力,又会加重肝脏的脂质蓄积,形成一个恶性循环[16]。本研究发现高脂饮食显著增加小鼠血清一些炎症因子的水平。通过检测肝脏组织中CD68的表达来反映肝脏中巨噬细胞数量,结果也同样发现高脂饮食显著增加肝脏组织中的巨噬细胞数量。霍山石斛治疗可以显著降低血清中炎症因子水平,并降低肝脏组织中巨噬细胞数量。这些结果表明,霍山石斛对非酒精性脂肪肝病的改善作用可能与其抗炎作用有关。

综上所述,霍山石斛具有很好的抗炎和降脂作用,并且能有效改善非酒精性脂肪肝损伤。本研究主要研究霍山石斛对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝损伤的保护作用及其机制,为有效开发霍山石斛的生物学功能提供科学依据。