Wnt2基因启动子DNA甲基化在子痫前期发病机制中的作用

刘玉芳 崔春燕 张振涛 王云芳

滨州医学院附属医院妇产科 山东 滨州 256603

子痫前期(preeclampsia,PE)是妊娠期特有的疾病,临床上以妊娠20周以后出现高血压、蛋白尿为特征,全球范围内妊娠妇女的发病率约为2%～8%,对母儿的危害均较大,是孕产妇及围产儿发病率和死亡率增高的主要原因之一[1-2]。子痫前期的发病机制颇为复杂,至今尚未完全阐明。研究发现,滋养细胞的浸润不足和血管生成障碍与子痫前期的发病密切相关[3]。Wnt信号通路在胎盘形成及发育过程中发挥着重要作用[4]。表观遗传修饰通过改变基因组DNA对转录因子的可访问性,影响基因的活动[5]。人类胎盘中异常的表观遗传学调控模式,尤其是易感基因启动子区的DNA甲基化状态的改变,与多种妊娠相关并发症的病理生理学有关[6]。双酚A导致小鼠胎盘Wnt2基因甲基化程度增加,引起Wnt2基因的表达下调,引发小鼠出现子痫前期样综合征[7]。因此,本研究推测,人类子痫前期患者的胎盘组织中Wnt2基因启动子区的DNA甲基化状态可能存在异常。本研究通过对正常晚期妊娠妇女、早发型重度子痫前期患者及晚发型子痫前期患者的胎盘组织进行研究,分别检测三组胎盘组织中Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度,以探讨Wnt2基因参与子痫前期发病的机制,为子痫前期的早期预测和临床治疗提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象及分组 收集2018年1月至2019年12月期间在我院产科病房经剖宫产分娩的早发型重度子痫前期患者30例作为早发型重度子痫前期组(early-onset severe preeclampsia group,ZPE),晚发型重度子痫前期患者30例作为晚发型重度子痫前期组(late-onset severe preeclampsia group,WPE),同期住院经剖宫产分娩的正常晚期妊娠妇女30例作为对照组(control group,NC)。重度子痫前期组诊断和分类标准参照《妇产科学》第八版诊断标准[8]。

纳入标准:重度子痫前期患者均平素月经规律,末次月经确切,经彩超证实为宫内单胎妊娠,且根据孕早期彩超核实孕周。排除标准:患者合并有慢性高血压、心脏病、肾病、糖尿病、甲状腺疾病等疾病;或存在不能用子痫前期解释的血、尿、生化异常;多胎妊娠。本研究取得我院医学伦理委员会的批准(伦理批件文件号为2021-S-004-01),获得患者知情同意。

1.1.2 胎盘标本 收集胎盘离体后30 min以内,在无菌操作下于胎盘母体面中央取绒毛组织数块,大小约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm,无菌磷酸盐缓冲盐水洗涤冲洗3遍,无菌纱布轻轻吸干水分,做好标记,放入小号液氮罐中,用小号液氮罐转移至-80℃冰箱保存。

1.2 实验方法

1.2.1 主要试剂和仪器 PCR试剂盒(立陶宛MBI公司),PCR 引物(上海invitrogen公司),ECL化学发光检测试剂盒(美国赛默飞世尔公司),琼脂糖 Agarose G-10(西班牙Biowest公司),Trizol(日本TaKaRa公司),TaKaRa Taq Hot Start DNA聚合酶(宝生物工程(大连)有限公司),甲基转移酶(美国Bio-labs公司),甲基化标准品(德国Qiagen公司),RNA酶(美国ABI公司);恒温水浴锅(美国公司Thermo公司),台式高速冷冻型微量离心机(北京DragonLab公司),-80℃冰箱(美国Thermo公司),热台(苏州威尔公司),漩涡振荡器(德国IKAika公司),PCR 扩增仪(美国BIO-RAD公司),凝胶成像系统(上海天能科技有限公司)。

1.2.2 胎盘组织基因组DNA的提取 称取胎盘组织25 mg,剪成碎片,按照试剂盒标准程序从裂解的胎盘绒毛组织中提取基因组DNA,将基因组DNA溶液收集到离心管中。将含有基因组DNA样品的PCR管放入PCR仪中,98℃,10 min;64℃,2.5 h;4℃,实用甲基化试剂盒按步骤对基因组DNA行重亚硫酸氢盐处理。

1.2.3 引物序列 甲基化特异性引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 甲基化特异性引物序列

1.2.4 甲基化特异性PCR扩增 对处理后的DNA进行甲基化特异性PCR扩增,PCR扩增条件:95℃预变性5 min,95℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,45个循环,最后72℃末段延伸5 min。PCR产物采用2%琼脂糖电泳,生物电泳图像分析系统分析结果。

2 结果

2.1 3组胎盘中Wnt2基因启动子区DNA甲基化程度的电泳结果 采用甲基化特异性PCR分析3组胎盘组织中Wnt2启动子区DNA的整体甲基化状态。电泳结果显示,3组胎盘组织甲基化及非甲基化均扩增出条带。这说明,Wnt2基因在这些样本中在所选区域均为不完全甲基化。见图1。

M.甲基化条带;U.b非甲基化条带。

2.2 3组胎盘中Wnt2基因启动子区DNA甲基化程度的比较 3组胎盘组织电泳条带的灰度扫描比较显示,ZPE组和WPE组的Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度均高于NC组(P<0.05),而ZPE组和WPE组之间Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度差异无统计学意义。见表2。

表2 3组Wnt2启动子区甲基化程度的比较

3 讨论

DNA甲基化是常见的表观遗传学修饰方式,表观遗传学修饰调控基因表达而不改变基础DNA序列。DNA甲基化是由5个DNA甲基转移酶蛋白家族建立和维持的。以S-腺苷甲硫氨酸为甲基供体,在DNA甲基转移酶的催化下,将甲基转移至胞嘧啶的第五位碳原子,形成5-甲基胞嘧啶,这常见于基因的CpG岛区域,该区域是DNA甲基化发生的主要部位[9]。CpG岛多位于基因的启动子区域,因此CpG岛的甲基化可能会对一些转录因子与基因调控区的结合造成干扰。DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化,从而影响了蛋白质与DNA的相互作用,甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。由于Z-DNA结构收缩,螺旋加深,使许多蛋白质因子赖以结合的原件缩入大沟而不利于转录的起始,导致基因失活。而且,序列特异性甲基化结合蛋白可与启动子区的甲基化CpG岛结合,阻止转录因子与启动子作用,从而阻止基因的转录过程[10]。

胎盘在胎儿发育过程中起着至关重要的作用,它既是一个交换器官,为胎儿提供营养和氧气交换,又是一个免疫器官,支持妊娠期胚胎的免疫耐受[11]。人类早期妊娠的胎盘呈现整体低甲基化的特征[12]。然而人类胎盘易感基因启动子区的DNA甲基化状态的改变,与多种妊娠相关并发症的病理生理学有关。胎盘组织中胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2,IGF2)和Wnt2基因启动子区的DNA甲基化水平与胎儿生长指标有关。其中,IGF2基因启动子区的DNA甲基化水平与新生儿出生体重和体重指数呈正相关,而Wnt2基因启动子区的DNA甲基化水平与上述胎儿生长指标呈负相关。患者胎盘Wnt2基因启动子区DNA过度甲基化时,低出生体重儿的发生概率显著升高[13]。人类染色体上第11位的印记基因重组人血小板白细胞C激酶底物同源性样域家族A成员2(PHLDA2)主要在胎盘表达,该基因的表达量与胎儿出生体重呈负相关,PHLDA2基因的调控主要通过CpG岛甲基化进行[14]。子痫前期患者胎盘组织中存在广泛的DNA甲基化异常改变[15-17]。Kristen等[18]研究发现,子痫前期胎盘中SPESP1、NOX5和ALCAM基因启动子区DNA过度甲基化。这表明,表观遗传学修饰在子痫前期的发生发展中发挥着重要作用。

本项目组前期研究显示,重度子痫前期患者胎盘组织中Wnt2基因的表达下调[19]。本研究采用甲基化特异性PCR方法,分别对正常晚期妊娠妇女、早发型重度子痫前期患者和晚发型重度子痫前期患者胎盘组织进行研究,检测Wnt2启动子区的整体DNA甲基化状态,结果显示,Wnt2基因在这些样本的所选区域均为不完全甲基化;与正常晚期妊娠妇女相比,早发型及晚发型重度子痫前期患者胎盘组织中Wnt2基因启动子区的DNA甲基化程度均明显增加。重度子痫前期患者胎盘组织中Wnt2基因表达的变化可能是通过其启动子区的DNA过度甲基化实现的。本项目组前期体外实验发现,Wnt2基因表达下降会影响滋养细胞的生物学行为,使其增殖能力、侵袭及迁移能力均减弱,增加滋养细胞的凋亡,从而影响滋养层的入侵和螺旋动脉的重塑,促使子痫前期的发生[20-22]。这表明Wnt2基因与子痫前期胎盘滋养细胞功能障碍有关,而Wnt2基因的表达可通过其启动子区的甲基化状态进行调控。因此干预Wnt2启动子区的DNA甲基化状态可实现调节Wnt2表达的目的。Wnt2基因将有望成为子痫前期早期预测及有效治疗的新靶点。

基因的表观遗传学调控除了基因启动子区的DNA甲基化修饰外,还包括组蛋白修饰及RNA调控等方式[23]。在子痫前期的发病过程中,是否存在其他的表观遗传学修饰及其调控机制还需要进一步的研究。