番茄红素对Fscn2基因敲除小鼠听力的保护作用

刘荣荣 李 玲 金安潼 王艳婷 商文静 陈 良 韩锋产

1 滨州医学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室 山东 烟台 264003;2 青岛大学附属烟台毓璜顶医院耳鼻咽喉头颈外科 山东 烟台 264000

增龄性耳聋(age-related hearing loss,AHL)又称老年性耳聋,是指随着年龄的增长机体听觉器官功能发生自然衰退以及听力减退的生理现象。增龄性耳聋不仅会影响日常生活,还可能诱发心理疾病。增龄性耳聋的发病与多种因素相关,如环境、遗传、听觉系统老化等,其中遗传因素起重要作用,约有一半的患者有遗传缺陷[1-3]。近年来,随着我国人口老龄化比例的持续升高,增龄性耳聋患者逐渐增多,全社会对老龄化群体的关注程度越来越高。目前,针对增龄性耳聋没有找到确切的病因,也没有可以治愈的药物。

Fascin2基因编码肌动蛋白交联蛋白,参与毛细胞静纤毛的形成[3]。Fascin2基因的错义突变会引起DBA/2J小鼠出现早发性、渐进性的听力减退[4-6]。为了深入研究Fascin2基因的功能,本研究前期在C57BL/6J小鼠背景下利用TALEN技术[7]敲除Fascin2基因,纯合型小鼠(Fscn2-/-)在3周龄时出现听力受损,程度逐渐加重,其中高频听力受损最为明显,24周龄时几乎变为全聋,耳蜗毛细胞缺失与听力减退的趋势一致,即Fscn2-/-小鼠是增龄性耳聋的一个小鼠模型[8]。

番茄红素(lycopene)属于类胡萝卜素的一种,是类胡萝卜素中最有效的抗氧化剂[9],在植物性食物中含量丰富,尤其是红色果蔬中含量较高,例如西红柿、番石榴及胡萝卜等。由于氧化应激与许多病理状况有关,摄入番茄红素能降低如炎症、癌症、代谢障碍和神经系统病变等慢性疾病的风险[12-13]。番茄红素可缓解顺铂诱导氧化应激及细胞凋亡所产生的耳毒性[15]。本研究前期发现,DBA/2J渐进性耳聋小鼠的耳蜗细胞缺失与细胞凋亡有关,抗凋亡药物(Z-VAD-FMK)能在一定程度上延缓小鼠的听力损失和耳蜗细胞损害[16]。因此,本研究推测番茄红素可能会通过抑制细胞凋亡以减轻Fscn2-/-小鼠的听力减退。本研究旨在为Fascin2基因相关疾病的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物饲养及分组 本研究对象为Fscn2-/-小鼠,是本实验室利用TALEN技术在C57BL/6J(B6)小鼠背景下敲除Fascin2基因制备的。将1周龄的Fscn2-/-小鼠随机分为2组,每组10只。番茄红素(SL8700,索莱宝公司)为脂溶性,将其溶解在玉米油中。实验组小鼠腹腔注射20 μg/g的番茄红素,对照组给予相同剂量(1.0 μL/g )的玉米油(C7030,索莱宝公司)。频率为隔天1次,药物注射持续35 d。两组小鼠除腹腔注射的药物不同外,其他饲养条件如光照、饮食、温度、湿度等均一致。小鼠饲养在滨州医学院SPF(specific pathogen free)级动物实验室,实验程序符合相关的伦理原则和标准,并得到我校实验动物使用和保护委员会的批准。

1.2 小鼠的基因分型与鉴定 剪取待测小鼠尾尖约2 mm,提取小鼠DNA模板,进行PCR扩增反应,根据电泳条带的数目及条带所对应的Markers位置分别确认野生型小鼠(Fscn2+/+)和纯合型小鼠(Fscn2-/-),选取纯合型Fscn2-/-小鼠进行实验。

1.3 小鼠形态观察及ABR阈值检测 每次腹腔注射药物前称量,并记录小鼠体质量。在电磁屏蔽及隔音室中应用脑干诱发电位仪检测小鼠的听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)阈值。刺激频率分别为8、16、32 kHz和click,刺激强度从10 dB SPL开始,以5～10 dB SPL的梯度逐渐增加。能够引出典型波形的声强为该小鼠的听力阈值。

1.4 毛细胞基底膜铺片及鬼笔环肽染色 取出小鼠耳蜗放入4%多聚甲醛固定24 h,然后用10% EDTA-Na2脱钙液(pH值为7.2～7.4)脱钙5 d,立体显微镜下解剖蜗管,剥离前庭阶膜和盖膜,修剪耳蜗基底膜为底回、中回和顶回。将修剪好的耳蜗基底膜用鬼笔环肽(Phallolidin,Alexa Fluor-488标记,A12379,Invitrogen公司)染色,并用荧光显微镜观察毛细胞,选取3个连续视野拍照。如果毛细胞纤毛束倒V形完整,则认为毛细胞存在。计算并分析耳蜗外毛细胞缺失的百分率。

1.5 Western blot检测 提取小鼠内耳蛋白,测定蛋白浓度(BCA蛋白浓度测定试剂盒,PC0020,碧云天生物技术公司)。12%的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离25 mg蛋白样品,将蛋白转移至PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭至少2 h。兔抗鼠IgG孵育过夜,用1×TBST洗膜3次,加入第二抗体(辣根过氧化物酶HRP标记的山羊抗兔IgG,ab97051,1∶5 000,购买自Abcam 公司)孵育1 h。使用凝胶成像系统记录分析结果。兔抗鼠Bax IgG(50599-2,1∶5 000)及兔抗鼠Bcl-2 IgG(26593-1-AP,1∶500)购买自武汉三鹰生物技术有限公司,兔抗鼠Cleaved caspase-12 IgG(ab62484,1∶2 000)购买自Abcam公司。

2 结果

2.1 小鼠的基因分型与鉴定 如图1所示,第1～5道所示为野生型小鼠(Fscn2+/+),PCR产物为394 bp;第6～8道为纯合子小鼠(Fscn2-/-),PCR产物为353 bp;箭头所指为DNA markers中400 bp 条带的位置。

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析小鼠的基因型

2.2 番茄红素对Fscn2-/-小鼠听力的影响 注射番茄红素对小鼠的生长状态无明显影响。观察两组小鼠的形态及体质量发现,实验组小鼠的生长发育水平与对照组比较差异无统计学意义,两组小鼠的体型相似且背毛光滑(图2A),体质量逐渐增加,且差异无统计学意义(图2B)。末次腹腔注射药物48 h后,麻醉小鼠,在屏蔽室中应用脑干诱发电位仪测试小鼠在各个音频(8、16、32 kHz及 click)刺激下的ABR阈值。结果显示:玉米油组小鼠8 kHz阈值为(51.11±5.46) dB,16 kHz阈值为(71.66 ±5.00) dB,32 kHz阈值为(75.00±6.61) dB,click阈值为(63.33±4.33) dB;番茄红素治疗组小鼠听力阈值下降,8 kHz阈值为(37.22±4.41) dB,16 kHz阈值为(59.44±4.64)dB,32 kHz阈值为(67.78±7.95)dB,click阈值为(54.44±11.58 dB(图2C)。实验组小鼠在各个频率声音刺激下的ABR阈值均降低,在8、16 kHz 和click音频刺激下的ABR阈值差异有统计学意义(P值分别为0.000 2,0.001 0,0.024 7)。这提示,20 μg/g的番茄红素对Fscn2-/-小鼠的听力具有保护作用。

图2 番茄红素对Fscn2-/-小鼠听力的保护作用

2.3 番茄红素对Fscn2-/-小鼠耳蜗毛细胞的保护作用 用鬼笔环肽对毛细胞进行染色,正常小鼠耳蜗外毛细胞有3排,纤毛束排列整齐且完整,整体呈倒“V”型。6周龄时,对照组Fscn2-/-小鼠耳蜗毛细胞排列欠整齐,结构欠完整,各回都有不同程度的外毛细胞缺失,其中底回的外毛细胞丢失率最高,为(10.00±1.15)%,中回外毛细胞丢失率为(5.44±0.87)%,顶回外毛细胞丢失率为(4.56±0.40)%。实验组小鼠腹腔注射20 μg/g番茄红素后,小鼠耳蜗毛细胞排列相对整齐,结构较完整,底回外毛细胞的丢失率均显著性减少,其中底回的外毛细胞丢失率为(6.33±0.51)%,中回外毛细胞丢失率为(4.00±0.67)%,顶回外毛细胞丢失率为(2.67±0.33)%。对两组小鼠底、中、顶回外毛细胞的缺失率进行比较,P值分别是0.010 4,0.534 9,0.258 3(图3)。这提示,20 μg/g的番茄红素对Fscn2-/-小鼠外毛细胞具有一定的保护作用。

图3 番茄红素对Fscn2-/- 小鼠耳蜗毛细胞的保护作用

2.4 Western blot检测凋亡相关蛋白在小鼠耳蜗的表达 实验组小鼠腹腔注射20 μg/g番茄红素后,耳蜗凋亡相关分子(Bax和Cleaved caspase 12)水平降低,抗凋亡蛋白Bcl-2水平升高;注射玉米油组Bcl-2/Bax的比值为(0.67±0.09),而注射番茄红素组Bcl-2/Bax的比值为(0.97±0.16),P=0.047 6(图4)。这提示,腹腔注射20 μg/g的番茄红素在Fscn2-/-小鼠内耳发挥抗凋亡作用。

图4 Western blot检测凋亡相关蛋白在番茄红素治疗Fscn2-/-小鼠内耳的水平

3 讨论

耳聋是一种常见的感觉障碍[17-18],是老年人群患病率排名第三的慢性疾病,与精神疾病、心理疾病、个人认知能力等有关[19-20]。引起耳聋的原因有多种,包括噪音、应用耳毒性药物、感染和基础疾病等,约有一半患者耳聋发病具有遗传因素[21-22]。目前,已发现150多个基因的缺陷会导致耳聋的发生[23]。Fascin2是新的耳聋相关基因,编码FSCN2蛋白,与毛细胞静纤毛的形成有关[3]。除作为结构蛋白外,FSCN2还具有调节功能等,如敲低Fascin2基因表达能增加顺铂诱导肾小管上皮细胞损伤的敏感性。Fascin2高表达则能降低该损伤的敏感性,缓解顺铂引起的细胞线粒体功能障碍和氧化应激[24]。

番茄红素有许多生物学活性,如抗癌、抗氧化、抗炎和神经保护等[25-26]。番茄红素的抗癌作用主要依赖于其强大的单线态氧猝灭剂特性、模拟解毒/抗氧化酶的产生、启动细胞凋亡、抑制细胞增殖和细胞周期进程或对细胞信号转导通路的调节等[14]。番茄红素通过抑制内质网应激通路及其介导的炎症反应和细胞凋亡对糖尿病肾病大鼠肾损伤起到保护作用[27]。在新生小鼠缺氧/复氧心肌细胞模型中,番茄红素能减轻缺氧/复氧损伤,缓解内质网应激,减少细胞凋亡[28-29]。番茄红素通过抗凋亡来对抗黄曲霉素B1诱导的线粒体损伤和睾丸损伤[30]。番茄红素可缓解顺铂诱导氧化应激及细胞凋亡所产生的耳毒性[15]。

前期研究显示,Fscn2-/-小鼠在3周龄时出现听力下降[8]。考虑到Fscn2-/-小鼠听力损失出现时间较早,本研究进行了早期的药物干预,即在小鼠1周龄时开始腹腔注射药物(20 μg/g)。结果发现,实验组小鼠在各个音频(8、16、32 kHz和click)刺激下的ABR阈值均有所降低。这提示,20 μg/g的番茄红素对Fscn2-/-小鼠的听力具有保护作用。为了进一步观察番茄红素对小鼠耳蜗组织的保护作用,本研究做了耳蜗基底膜铺片,用鬼笔环肽染色毛细胞纤毛束,观察毛细胞形态结构和数量的变化,结果发现,6周龄的对照组小鼠耳蜗各回都有不同程度的外毛细胞损害及缺失,而腹腔注射 20 μg/g番茄红素后,小鼠耳蜗顶回、中回和底回外毛细胞的丢失率均减少。一般来说,耳蜗底回和顶回的毛细胞分别感受高、低频声音刺激信号[31]。20 μg/g番茄红素对Fscn2-/-小鼠听力的改善作用与其对耳蜗毛细胞的保护有关。为了探讨番茄红素对小鼠听力保护的作用机制,本研究检测了两组小鼠内耳凋亡相关蛋白的表达,结果显示,实验组小鼠耳蜗中Bax和Cleaved caspase 12的水平均降低,而Bcl-2的水平升高。这提示,番茄红素的听力保护作用可能与抑制细胞凋亡相关分子的表达有关。

经不同途径(如口服、腹腔注射、皮下注射)单次给小鼠3 mg/g 的番茄红素,未发现有任何毒副作用[32]。本研究同样未观察到注射番茄红素对小鼠生长发育的影响。关于腹腔注射不同剂量番茄红素对Fascin2基因敲除小鼠听力的影响有待进一步研究。

综上所述,番茄红素的作用广泛,一定浓度的番茄红素对Fascin2基因敲除小鼠的听力减退和耳蜗毛细胞损害有保护作用。本研究有望为Fascin2相关疾病的防治提供新途径。