水生动物致病菌sRNA 研究进展

王荃生，刘苏，王朵，胡永华

（1.河北农业大学海洋学院，河北 秦皇岛 066000；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南 海口 571101）

细菌中的sRNA（small RNA）是一类长度在40～500 nt（Nucleotide）的非编码的起调控作用的小分子RNA，主要通过与靶mRNA 或靶蛋白质结合发挥生物学功能，是基因表达的重要调控因子[1]。研究表明，大部分sRNA 需要依靠分子伴侣蛋白才能有效地发挥其调控作用[2]。病原菌在与其宿主长时间的互作过程中，产生了能感知宿主信号变化的调节基因。当宿主环境改变且释放相关信号因子时，相应的病原菌sRNA 会即刻调控相关基因的表达，以抵抗宿主环境因子的胁迫。目前已发现多种在细菌毒力调控中起重要作用的sRNA。这些sRNA 通常只需要经转录过程就能发挥作用，大大减少细胞代谢的各种消耗，使其快速适应新的环境[3]。在与人类密切相关的致病菌中，如大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）和沙门氏菌（Salmonella）等，sRNA 的研究较为深入，其研究结果极大促进了病原菌致病机制的阐析[4-9]。

相比于人类致病菌，水生动物致病菌所处环境特殊性，导致包括sRNA 在内的许多基因功能出现明显差异。在溶藻弧菌中，sRNA srvg23535 参与该病原菌对碳源和氮源的利用、对渗透压的耐受性和pH 胁迫反应[10]；sRNA srvg17985 参与该病原菌对Gly-Glu 碳源的利用、对NaCl 的耐受性、对尿素的耐受性和碱胁迫反应[11]；sRNA Qrr 参与该病原菌的生长能力、运动性、形成生物膜能力、细胞外多糖含量、产生丝氨酸蛋白酶的能力和对宿主的侵染能力等[12]。在杀鱼爱德华氏菌中，sR082 与该病原菌抵御酸胁迫相关，sR012 与氧化压力密切相关，而EsR240 与酸胁迫和氧化压力都有关相关[13-15]。在无乳链球菌中，SQ18、SQ485 和SQ893 三个sRNA 调控相邻基因的表达，并且SQ18 asRNA 通过反义机制下调Sip 基因的表达[16]。目前，水生动物致病菌sRNA 的研究起步较晚，其功能和机制仍亟待阐明。

本文概述了sRNA 的调控机制及其在水生动物致病菌如溶藻弧菌、杀鱼爱德华氏菌、无乳链球菌、鲁氏耶尔森氏菌、维氏气单胞菌、副溶血性弧菌中的研究进展。

1 sRNA 调控基因表达的机制

随着对sRNA 调控细菌基因表达机制研究的深入，人们对sRNA 在细菌生命活动中扮演的角色有了更深刻、更多元化的认识。以下是目前比较清晰的sRNA 调控机制。

1.1 sRNA 与靶mRNA 碱基配对调控目的基因表达

细菌sRNA 通过碱基配对与靶mRNA 的编码区或非翻译区结合，这是sRNA 调控基因表达的主要方式，主要影响靶mRNA 的翻译或（和）稳定性产生，促进或降低mRNA 的翻译和降解。

1.1.1 顺式编码的sRNA

顺式编码的sRNA，亦称反义RNA，通常是由其所调控靶标基因的互补链转录而来，位于与其所调控的mRNA 互补的位置上，且编码在相反的链上，二者的碱基完全互补配对[17]。顺式编码的sRNA 主要分布在质粒、转座子中[18]，可与靶标mRNA 完全互补配对调控目标基因的表达，该类sRNA 调控的基因大都与细菌毒力有关，例如大肠杆菌中的gadXW 操纵子受顺式编码sRNA 的调节[19]。

1.1.2 反式编码的sRNA

反式编码的sRNA 从与其靶RNA 基因完全不同的基因组位置转录而来[18]，与其靶mRNA 的碱基通过不完全互补配对的方式结合。有限的互补性使得反式编码的sRNA 能够与多个mRNA 结合，这一特征使其能全面地调控细菌的生理反应[20]。细菌sRNA 多为反式编码RNA，这类sRNA 发挥功能通常需要分子伴侣蛋白协助。现已发现的能在sRNA与mRNA 的结合中起作用的分子伴侣有Hfq 和ProQ 两种。目前对Hfq 蛋白介导sRNA 与mRNA 结合的机制有两种推测：一种是Hfq 改变了与之结合的sRNA 的结构，使其暴露出与靶mRNA 配对的序列，缩短了配对所需的时长；另一种是Hfq 增加了该空间某一区域内sRNA 和mRNA 的含量，使它们的结合几率增大[21]。最新研究在细菌中检测出一种新的分子伴侣蛋白ProQ，虽然它与sRNA 结合并稳定sRNA 的分子机制尚未清楚，但已证实能促进sRNA 和所调控的mRNA 的碱基配对[22]。

1.2 sRNA 与靶蛋白质作用从而影响其功能

sRNA 除了以碱基配对的方式发挥其调控功能外，能直接与靶蛋白相互作用影响毒力基因的表达。细菌中的6S RNA 能保证细菌各阶段生存所需要的营养，降低对外界各种紧张性刺激物引起的细胞生理反应而储存能量。6S RNA 能通过模拟一个开放的启动子复合体，将RNA 聚合酶从靶启动子置换下来，从而调节特定基因的表达[23]。例如CsrA蛋白最近被证明与细菌的毒力有关，它的表达受到CsrB 和CsrC 这两种sRNA 的调控[24]。

1.3 sRNA 本身具有特殊活性

除上述sRNA 作用机制外，有一类sRNA 本身就具有特殊活性，如4.5S RNA、tmRNA 和M1 RNA等。4.5S RNA 能结合信号识别颗粒和它的受体共同把蛋白质运输到特定的内质网或细菌质膜，影响蛋白质的分泌过程。倘若该基因缺失，将抑制蛋白质的合成。tmRNA 在各种细菌中均有发现，既具有tRNA 的功能，又具有mRNA 的作用[25]。tmRNA 可监控细菌蛋白质合成的过程和停滞蛋白质水解的过程，有助于调控基因表达的速度和精确度[26]。M1 RNA 具有典型的内切酶活性，能够对tRNA 5' 末端进行剪切并形成成熟的tRNA[27]。

2 sRNA 在水生动物致病菌中的研究进展

目前在溶藻弧菌中已被鉴定的sRNA 有750 余个，在杀鱼爱德华氏菌中已被鉴定的sRNA 有150余个，在无乳链球菌中已被鉴定的sRNA 有197 个，在鲁氏耶尔森氏菌中已被鉴定的sRNA 有2 个，在维氏气单胞菌中已被鉴定的sRNA 有1 个，在副溶血性弧菌中已被鉴定的sRNA 有1 个，已经进行研究的sRNA 大都被发现与细菌抗逆性、运动性和致病性相关，个别sRNA 与细菌对碳源和氮源的利用、细胞外多糖含量和产生丝氨酸蛋白酶的能力相关，具体内容如下。

2.1 溶藻弧菌sRNA

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是革兰氏阴性病原菌[28]，是一种机会性病原体[29]，可感染、引发多种水生动物疾病[30]，给水产养殖业造成巨大的经济损失。Liu 等[31]发现，溶藻弧菌中sRNA 伴侣Hfq 的缺失导致溶藻弧菌对渗透压力、高温和铁饥饿等环境压力更加敏感，运动性和生物膜形成能力消失，毒力基因表达下调等，表明sRNA 可能与溶藻弧菌的逆境适应及毒力相关。2018 年Deng 等[10]鉴定了溶藻弧菌sRNA srvg23535，发现srvg23535 保守性高且仅存在于弧菌中；通过构建sRNA 的敲除株发现srvg23535 在碳源和氮源的利用以及渗透压和pH胁迫反应中发挥了重要作用。Deng 等[11]发现sRNA srvg17985 的缺失导致溶藻弧菌对Gly-Glu 碳源的利用减少，对NaCl 耐受性更强，但对尿素的耐受性更弱；在pH=9.5 时sRNA srvg17985 抑制L-丝氨酸的脱氨基作用，促进X-β-d-葡糖苷酸的水解，影响碱胁迫反应。

直到2019 年，溶藻弧菌sRNA 才得到系统性鉴定。Peng 等[32]鉴定了溶藻弧菌中749 个sRNA，其中128 个sRNA 响应氧化应激压力，相应地有1 870 个基因也响应氧化应激压力；并发现这些sRNA 可能调控与铁转运、过氧化氢酶、GSH 依赖性防御系统、电子传递和应激反应等相关基因的表达。周欣等[33]鉴定了溶藻弧菌5 个细胞密度依赖性sRNA，发现它们均具有Hfq 结合位点区，对群体感应系统核心元件LuxR 和AphA 具有调控作用；发现这些sRNA或通过激活周生鞭毛合成蛋白LafK 和LafA 调控细菌的泳动能力，或作用于极生鞭毛合成相关蛋白FliS 和FlaK 影响游动能力，或调控生物被膜调控因子SypG 来影响生物被膜的形成。最近，Liu 等[12]发现，与野生型菌株相比，溶藻弧菌sRNA Qrr 突变体的生长能力显著减弱，运动性减弱，形成生物膜的能力增强，细胞外多糖含量增加，产生丝氨酸蛋白酶的能力增强，LD50值增大。

2.2 杀鱼爱德华氏菌sRNA

杀鱼爱德华氏菌（Edwardsiella piscicida），又称迟缓爱德华氏菌（E.tarda）是一种重要的鱼类病原菌，每年给全世界的水产养殖业造成了巨大的经济损失[34]。虽然杀鱼爱德华氏菌中的多种毒力因子（或系统）如黏附因子、铁摄取调节因子、抗血清能力、Ⅲ与Ⅵ型分泌系统已被鉴定和阐析[35]，但对sRNA的研究可以从一个新角度揭示杀鱼爱德华氏菌复杂的毒力基因调控网络。早在2014 年，Hu 等[36]发现sRNA 分子伴侣Hfq 的缺失下调了杀鱼爱德华氏菌多个毒力基因的表达，降低了细菌的抗逆性和致病性。2017 年，通过生物学信息学分析，Sun 等[37]在杀鱼爱德华氏菌中预测了10 个sRNA，其中2 个sRNA 与tmRNA 和GcvB 同源，其余8 个为未报道的sRNA。这些sRNA 预测的靶基因直接或间接与毒力相关，表明sRNA 可能参与了杀鱼爱德华氏菌致病性。2018 年，Du 等[38]利用RNA-seq 技术首次系统鉴定了杀鱼爱德华氏菌sRNA，发现了148 个sRNA，其中129 个为新sRNA。在逆境（酸性、缺铁和氧化压力）条件下，103 个sRNA 表达出现差异（DEsRNA），同时1 615 个mRNA 的表达也发生了显著变化（DEmRNA）。基于IntaRNA 预测、DEsRNA与DEmRNA 之间的相关性分析，预测有103 个DEsRNA 调节769 个靶mRNA。靶基因的功能分析表明，sRNA 广泛参与多种生理活动，包括抗逆性和致病性，进一步的感染试验证实sRNA 参与了E.piscicida 的致病性。靶基因中包含了大量的转录因子，表明sRNA 很可能与杀鱼爱德华氏菌复杂的基因调控系统有非常密切的关系。这些结果表明，sRNA 在杀鱼爱德华氏菌抗逆性和致病性中起着重要作用。随后，周海珍等[13，14]通过构建sRNA 的缺失突变株，发现sR082 参与了杀鱼爱德华氏菌的耐酸压力，而sR012 参与了杀鱼爱德华氏菌的抗氧化压力，明确了sR082 和sR012 在细菌感染宿主细胞、侵染组织等致病过程中起重要作用。Gao 等[15]鉴定了3 个sRNA，发现EsR240 与抗酸性、抗氧化性密切相关，EsR240 缺失突变株显著降低了杀鱼爱德华氏菌对宿主的侵染能力，其LD50升高了近7 倍。这些研究结果充分表明，sRNA 是杀鱼爱德华氏菌的抗逆性和致病性重要的调节者。

2.3 其他水生动物致病菌sRNA

无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是革兰氏阳性病原菌[39]，还是一种人兽共患病原菌[40]，能引发鱼类无乳链球菌病，该细菌经常爆发已造成严重的经济损失。Pichon 等[16]鉴定了无乳链球菌中的197 个sRNA/asRNA 基因，并发现SQ18、SQ485 和SQ893 三个sRNA 对相邻基因的表达有调控作用，而SQ18 asRNA 通过反义机制下调Sip 基因的表达。

鲁氏耶尔森氏菌（Yersinia ruckeri）是一种革兰氏阴性杆状肠杆菌[41]，与许多肠道细菌一样，它是一种兼性细胞内病原体[42]，能引发肠炎红嘴病[43]，导致全球鲑鱼养殖业遭受重大经济损失。Acuña等[44]发现，RyhB-1 和RyhB-2 两个sRNA 对该致病菌的胞内增殖能力具有调控作用，还调节与铁稳态、代谢和运动性相关基因的表达。

维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）是革兰氏阴性病原菌[45]，一种水生环境中大量存在的鱼-人-畜机会致病[46]，能引起淡水鱼败血症和溃疡综合征[47]。研究发现，sRNA AvrA 能调控iscR mRNA 来增加该致病菌的SmpB 突变株对氧化应激的耐受性[48]。

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水生革兰氏阴性病原菌[49]，是一种模式海洋细菌[50]，作为一种机会致病菌导致全球范围内的海产品感染，造成巨大的经济损失[51]。不同于其他细菌中的sRNA Qrr2，副溶血性弧菌中的sRNA Qrr2 独立于sigma-54 表达，可作为唯一的Qrr sRNA 来控制该菌中的群体感应，进而影响毒力的表达[52]。

3 结语和展望

近年来，科研工作者已在溶藻弧菌、杀鱼爱德华氏菌、无乳链球菌、鲁氏耶尔森氏菌、维氏气单胞菌、副溶血性弧菌等水生动物致病菌中鉴定出上千个sRNA，现有的研究表明sRNA 是细菌适应环境变化和侵入宿主所需的调控网络的一部分，在病原菌对碳源和氮源的利用、氧化压力胁迫、缺铁胁迫、pH 胁迫、运动性和毒力等方面发挥重要作用，但sRNA 调控机制研究的广度和深度还明显不够。加强sRNA 调控机制的研究将对发展以sRNA 为靶标的疫病防控新技术提供理论基础和新思路。