中华蛸受精卵人工孵化研究

孙以康，李美帅，陈四清，边力，刘永胜，常青

（1.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；2.中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室，山东 青岛 266071；3.烟台市海洋经济研究院，山东 烟台 264006）

中华蛸（Octopus sinensis）[1-3]俗称“八爪鱼”、“章鱼”、“母猪章”和“红章”等，主要分布于温带、亚热带和热带海域，是我国南方重要经济物种[4～6]。中华蛸肉细味美，蛋白质含量高，可生食也可制成干品，有补血益气、收敛生肌的药用价值，作为海味和滋补品深受人们喜爱，在日本、韩国有更大市场，是重要的出口产品[7-10]。近几年，大量捕捞及生态环境的不断恶化，中华蛸资源量衰减，不能满足市场需求[11,12]。但中华蛸生长周期短、生长速度快、食物转化率高和产卵量大，极具养殖潜力[13,14]。目前，中国、日本等国家已开始中华蛸人工养殖技术的研究。

蛸类产卵后雌蛸守护卵群，用漏斗不断给卵群喷水，清理卵群表面杂物，确保卵群有充足的氧气，护卵期间雌蛸几乎不离开卵群，摄食量极少，往往因消耗过大等原因而死亡[15,16]。中华蛸繁育时，个别亲蛸经常在护卵期间意外死亡或离开孵化巢，失去亲体看护的受精卵孵化率极低，大多会出现腐败死亡。有研究表明，在无亲蛸看护下受精卵发育10 d左右便会滋生霉菌和原生动物停止发育[17,18]。中华蛸受精卵在无亲体看护下，发育到何期可以孵出幼体，目前尚没有研究报道。若可以实现中华蛸受精卵的全人工孵化，便可以通过运输受精卵串的方式代替亲蛸运输，降低运输成本，有利于中华蛸养殖产业的扩大；中华蛸亲体在产卵后有衰老现象，并且在护卵期间摄食量极少，亲体完成护卵后的体重较产卵前明显变轻，肉质明显变差，若能实现中华蛸受精卵全人工孵化，可以将中华蛸亲体及时卖出而降低养殖成本。

本实验观察了中华蛸受精卵发育状态，在受精卵不同发育时期从孵化巢取出，进行人工孵化，研究中华蛸受精卵人工孵化与中华蛸亲体护卵孵化的差异，寻找中华蛸受精卵可进行人工孵化的最佳发育时期，可为中华蛸受精卵人工孵化技术提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 亲体采捕及培育

实验所用中华蛸亲体捕自福建连江海域，体质量为0.68～1.74 kg，运至烟台天源水产有限公司牟平实验基地，放入水泥池（6 m×2 m×1.5 m）中培育。培育池中放置蛸巢（图1），蛸巢间距在50 cm 以上。所用海水是经砂滤池过滤的自然海水，盐度29～32，水温21 ℃～25 ℃，日换水量150%～200%。

图1 蛸巢Fig.1 The nest of O.sinensis

每日下午投喂菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）、栉孔扇贝（Chlamys farreri）、冻虾、日本蛤（Charybdis japonica）等，第二天上午清理残饵。培育第一天亲体便有交配现象（图2），经过50 d 培育亲体自然产卵。

图2 中华蛸交配Fig.2 O.sinensis mating

1.2 卵串处置方法对孵化率影响试验

中华蛸受精卵分次成熟，分批产出，卵串在孵化巢中如同麦穗紧密排列（图3-a、图3-b），卵粒半透明形如米粒[19]（图3-c）。选取四只同一天产卵的亲蛸，每天观察卵串的产出情况，在相应位置做好标记，受精卵经亲体看护孵化24 d 左右幼蛸破膜而出。通过观察胚胎发育状态，将特定时期的受精卵从蛸巢取出，放入筛盆人工孵化。筛盆固定于网筐上（图4），周围放置1～2 个气石。筛盆网眼小于幼蛸，上沿稍高出水面，以防初孵幼蛸逃逸。孵化期间水温22.8 ℃～26.4 ℃，盐度29～32，日换水量180%～250%。

图3 中华蛸受精卵串Fig.3 A cluster of O.sinensis fertilized eggs

图4 实验装置Fig.4 Experimental device

根据中华蛸受精卵发育天数以及关键结构（色素斑、吸盘、眼点等）的发育程度，将受精卵分为A、B、C、D、E、F、G、H 8 个时期[20]，每个时期所取受精卵分为四组。对照组为卵串间隔3～4 cm 放置于筛盆；组1 为卵串间隔3～4 cm 放置于筛盆，每天用洗瓶吹洗卵串，每次间隔1 h；组2 为卵串紧密叠放置于筛盆；组3 为卵串紧密叠放置于筛盆，每天用洗瓶吹洗卵串，每次间隔1 h。受精卵孵化成功后，统计孵出和未孵出幼蛸的数量，计算孵化率。

1.3 由亲蛸护卵和没有亲蛸护卵孵出的幼蛸7 日成活率比较

选取对照组F、G 和H 期孵出的幼蛸和组1 在F、G 和H 期孵化的幼蛸以及由亲蛸护卵孵化的幼蛸各100 只，置于20 L 的水桶中，每组设三个平行。以卤虫无节幼体为幼蛸的开口饵料[21,22]，在转移至水桶后的0 h、24 h、48 h 投喂相同重量的卤虫并吸底换水，日换水量为20%，每天及时吸出死亡幼蛸。

按下式计算孵化率和成活率：

实验数据以平均值±标准差（means±SD）表示，用Excel 2019 和SPSS 25.0 统计软件进行正态性和方差齐性检验及单因素分析，以P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同时期受精卵的发育状态

在蛸巢中不同发育期的受精卵串的发育状态如图5 和图6 所示。水温22.8～26.4 ℃时，A 时期为发育1 d 的呈半透明状受精卵，外层具有胶质保护膜，无特殊分化的结构（图5-a）；B 时期为发育8 d的受精卵，已分化发育出眼、腕、漏斗等胚胎原基（图5-b）；C 时期为发育11 d 的受精卵，胚胎眼点呈红色，此时的卵串每个受精卵上均有红色眼点（图5-c、图6-a）；D 时期为发育14 d 的受精卵，胚胎眼点由红色转为紫黑色，腕足已清晰可见（图5-d、图6-b）；E 时期为发育16 d 的受精卵，胚胎身体上开始出现5～8 个色素斑，色素斑呈浅红色，腕足上的吸盘清晰可见（图5-e、图6-c）；F 时期为发育18 d 的受精卵，胚胎身体上浅红色素斑增至10～18 个（图5-f、图6-d）；G 时期为发育20 d 的受精卵，身体上的色素斑进一步增加至20～24 个，其中胴体背部上的色素斑颜色变深呈暗红色，卵串整体呈灰色（图5-g、图6-e、图7-a）；H 时期为发育23 d 的受精卵，卵串呈灰褐色，由于临近自然孵化日期，此时将卵串取出胚胎会因外界环境刺激提前1 d 孵化。孵出的幼蛸腕部吸附有尚未吸收完全的卵黄（图5-h、图7-b）。

图5 中华蛸发育状态Fig.5 The developmental diagram of fertilized eggs in O.sinensis

图6 中华蛸受精卵串Fig.6 The developmental diagram of fertilized egg cluster in O.sinensis

2.2 不同发育时期从蛸巢中取出对孵化率的影响

将发育至A、B 时期的受精卵从蛸巢中取出人工孵化时，无论哪种方式都无法孵出幼体，发育7 d左右便停止发育，此受精卵较正常受精卵轻微膨大，表面呈浅红色，卵黄浑浊变白。发育至C 时期时将其和亲蛸分离进行人工孵化，仅有卵串分散放置时（对照组、组1）有幼体孵出，孵化率极低。选取C、D、E 时期的受精卵进行人工孵化时，虽可以少量的孵化出幼蛸，但孵化出幼蛸的受精卵多数位于卵串上卵粒相对稀疏的位置，且未孵化的受精卵浑浊发灰没有光泽（表1）。

表1 受精卵孵化率（%）Tab.1 Hatching rate of fertilized egg（%）

受精卵发育到F、G 时期时开始人工孵化，孵化率明显升高，H 时期时孵化率可达99%。当受精卵发育至F、G 时期时，卵串中央以及卵串两端的受精卵均可孵化成功，未孵化成功的受精卵卵黄变白，卵粒发灰失去光泽，在解剖镜下观察时，胚胎不蠕动。H 时期的受精卵串取出放入筛盆后便有幼蛸孵化，2 h 后卵串上的受精卵只有少数孵化失败。

在人工孵化过程中，排列稀疏的卵串孵化率明显高于排列紧密的卵串，且随着受精卵临近孵出日期，吹洗卵串对孵化率的影响逐渐减（表1、图8）。

图8 不同条件下受精卵孵化率与发育时期的关系Fig.8 The relationship between hatching rate and developmental period of fertilized eggs under different conditions

2.3 幼蛸7 日成活率比较

人工孵化和自然孵化的F、G 时期受精卵所得幼蛸7 日成活率无显著差异（P>0.05）。由H 时期受精卵人工孵化所得幼蛸7 日成活率显著低于自然孵化幼蛸和F、G 时期受精卵所孵化的幼蛸，其平均7 日存活率仅为11.7%（P<0.05）（表2）。因此，当受精卵发育至G 时期时取出人工孵化可得到较好的孵化效果。实验过程中，F、G 时期受精卵所孵出的幼蛸以及自然孵出的幼蛸大多聚集在水体表面，只有少数位于水体的中下层，而H 时期提前1 d 孵化的幼蛸，大多聚集的水体中下层。此现象也表明，H时期提前孵化的幼蛸活力较差。

表2 幼蛸7 日成活率（%）Tab.2 Survival rate of 7 day old O.sinensis（%）

3 讨论

3.1 不同发育时期脱离亲体对孵化率的影响

波纹龙虾（Panulirus homarus）、日本米虾（Caridina japonica）和中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）的胚胎离体孵化时，在任何发育时期均能孵化出健康的幼体，且随着临近出膜期，胚胎的孵化率逐渐升高[23-25]。中华蛸受精卵脱离亲体进行人工孵化时，发育前期的受精卵无法孵出幼体，当卵串排列稀疏时，从黑珠期开始，受精卵也具有随着临近出膜期孵化率逐渐升高的趋势。

将中华蛸不同发育时期受精卵串取出人工孵化时，A、B 时期的受精卵发育7 d 左右卵黄浑浊变白，内部有丝状结构，停止发育，推测受精卵可能是被霉菌或者其它原生动物寄生，具体是何种生物还有待于进一步探究。当受精卵发育至G 时期取出时，胚胎已基本发育成型，在显微镜下观察发现，胚胎有时会轻微扭动，卵黄也已较小，推测此时对于霉菌或其他寄生者来说，由于幼蛸免疫力增强、受精卵内营养物质减少、胚胎临近孵出时间没有充足的寄生时间等原因不再利于寄生。当受精卵发育至H 时期时已非常临近自然孵出日期，将蛸巢提出水面取受精卵时，因为渗透环境变化剧烈，胚胎在卵膜内剧烈蠕动，提前1 d 破膜而出，因此H 时期孵化率高但成活率低。

3.2 卵串的疏密程度和吹卵对孵化率的影响

中华蛸亲体在护卵期间会不断用漏斗给卵群喷水，并时常用腕足拨弄卵群，这样能清理受精卵上所粘附的杂物，使卵群有充足的氧气。受精卵串排列紧密组的孵化率均低于卵串排列稀疏组，在相同疏密程度下吹洗卵串也可提高孵化率，这表明在人工孵化时，将卵串间隔开保持充足的溶氧是确保孵化成功的关键。在拟目乌贼（Sepia lycidas）的人工孵化过程中孵化率也会随着孵化密度的升高而降低，且在相同密度下充气与否会显著影响孵化率[26]。

通过对照组、组1 和组3 的对比表明，随着受精卵临近孵出，吹洗卵串对孵化率的影响逐渐减小，推测这可能和霉菌、原生动物等没有充足的寄生时间有关，因此在生产实践过程中，只需保证卵串排列相对稀疏便可得到较高的孵化率。

3.3 刚出膜幼蛸7 日成活率的比较

幼蛸出膜后腕部会包裹有尚未吸收完全的外卵黄囊，经6～12 h 外卵黄囊被完全吸收，但被覆在消化腺周围的内卵黄囊需2～3 d 才会被消化吸收完全[27]。在幼蛸7 日成活率实验中，第3 d 时每个实验组的幼蛸成活率均有明显下降，推测和内卵黄囊消化吸收完全，能量供给不足有关。H 时期所孵幼蛸较正常孵化幼蛸提前1 d 孵出，其7 日成活率显著低于自然孵化的幼蛸以及F、G 时期孵化的幼蛸，推测其原因是由早产所导致。