激光散射法测定非达霉素粒度的方法开发与验证

孙超?康帅?吴谧?李晓露?高福然

摘要：目的 建立激光散射法测定非达霉素原料药粒度的方法。方法 采用Mastersizer 2000激光粒度仪，干法测定，标准文丘里管，样品折射率1.50，颗粒吸收率0.01，分散气压0.20 MPa，振动进样速度80%，背景和测定扫描时间10 s，遮光度范围0.5%～5.0%，每个试样重复测定2次。结果 所建立方法的重复性、中间精密度、耐用性考察结果的RSD均小于10%。结论 该方法准确度高、重复性好，可用于非达霉素原料药的粒度测定。

关键词：激光散射法；非达霉素；粒度；分散气压；振动进样速度

中图分类号：R917文献标志码：A

Development and verification of laser scattering method for determining the particle size of fidaxomicin

Sun Chao， Kang Shuai， Wu Mi， Li Xiao-lu， and Gao Fu-ran

（1 National Engineering Research Center of Microbial Medicine， Hebei Industrial microbial Metabolic Technology Innovation Center，New Drug Research & Development Company of NCPC， Shijiazhuang 052165）

Abstract Objective To establish a laser diffraction analysis method for the determination of particle size of fidaxomicin. Methods The Mastersizer 2000 laser diffraction particle size analyzers was used with a model of dry determination and standard venture tube. The conditions were as follows： The index of refraction was 1.50， the absorption was 0.01， the dispersing pressure was 0.20 MPa， the feed rate was 80%， the measurement time for background and samples was 10 seconds， the obscuration was 0.5%～5.0%， each sample repeated measurement twice. Results The RSDs of the repeatability， intermediate precision and durability of the determined method were all less than 10%. Conclusion The method has high accuracy and good repeatability， can be used to determine the particle size of fidaxomicin.

Key words Laser diffraction method; Fidaxomicin; Particle size; Dispersing pressure; Feed rate

艱难梭菌（Clostridium difficite）是抗生素相关性腹泻和假膜性肠炎的主要病原菌，艰难梭菌感染 （Clostridium difficile infection ，CDI）可导致严重腹泻、结肠炎症，严重感染可导致患者死亡。治疗艰难梭菌感染的传统药物是甲硝唑和万古霉素，甲硝唑和万古霉素可以有效抑制艰难梭菌，但随着耐药菌株的出现，治疗效果逐渐降低，同时长期应用甲硝唑和万古霉素肠道正常菌群环境遭到破坏，增加艰难梭菌感染复发的风险[1]。2011年5月27日，FDA 批准Optime公司新药非达霉素（fidaxomicin，商品名 Dificid?）用于治疗艰难梭菌感染伴随的腹泻，非达霉素的临床治愈率高、复发率低，是目前理想的抗艰难梭菌药物。

非达霉素（fidaxomicin）是1种由放线菌属发酵而来的新型窄谱大环内酯类抗生素，分子量为1058.04，分子式为C52H74CL2O18，易溶于甲醇、乙醇、碳酸钠水溶液等，微溶于苯、丙醇、二氯甲烷、丙酮，不溶于己烷、水、碳酸氢钠水溶液[2]。经本实验室测定非达霉素在pH1.0、4.5、5.8和6.8的水性介质中几乎不溶，原料药的粒度决定了原料药的比表面积，对口服制剂而言，直接影响制剂的处方、制备工艺、溶出情况，从而影响药物的疗效，对于液体制剂，也会影响到其处方及制备工艺，了解原料药的粒度分布情况，对于制剂开发非常重要。

粉体粒度测定常见的分析方法有显微镜法、筛分法和激光散射法等[3]。激光散射法具有操作简便、准确度高、测量范围广等优点，广泛应用于原料药粒度分布的质量控制[4-5]。

非达霉素的结晶形态为棒状（图1），流动性差。本文通过对进样方式、振动进样速度、分散气压以及测量时间等参数的考察，建立了激光散射法测定非达霉素原料药粒度分布的方法，用于非达霉素原料药的粒度测定和生产中的粒度质量控制。

1 仪器与材料

Mastersizer 2000激光粒度仪（Malvern Panalytical Ltd）；BT-1001智能粉体特性测试仪（丹东百特仪器有限公司）；BX51显微镜（Olympus Ltd）；非达霉素原料药（本公司自制，批号YNFN1810402、YNFN1811401、YNFN1811402、YNFN2204401、YNFN2204402、YNFN2204403）。

2 分析方法的建立

2.1 进样方式选择

激光粒度仪进样方式分为湿法进样和干法进样两种。湿法进样测定重复性好，测定结果准确，缺点是样品测量时间长、样品池清洗困难，有些样品很难找到合适的分散剂，同时使用有机分散剂会污染环境。干法进样测定简单快捷，重复性略差。

非达霉素在水中不溶，用水作为分散剂测量非达霉素原料药粒度时，非达霉素在水中发生团聚，加入表面活性剂并进行超声后，随着测量时间的延长，测量结果逐渐增大，表示仍有团聚现象，难以形成均匀的分散体系，因此本研究选择干法测定。

2.2 测量参数的选择

采用干法测定粒度分布时，样品通过振动盘进入系统后被气流吹散，通过样品池产生激光散射信号，检测器不能识别测定结果是测试样品单个颗粒的粒度，还是团聚的颗粒粒度。根据检测样品性质的不同，选择合适的分散气压、振动进样速度和测量时间，确保颗粒分散完全且未被气流粉碎，是决定干法测定准确与否的关键。

2.2.1 分散气压的考察

非达霉素原料药易团聚不易分散，调高分散气压有利于保证进样连续性，将振动进样速度设为80%，测量时间10 s，分散气压分别设置为0.10、0.15、0.20、0.25和0.30 MPa进行粒度测定，结果见表1。

由表1可知，D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）在0.20～0.25 MPa时，粒度测定结果变化较为平缓，说明颗粒分散状态良好，为避免颗粒被分散气压破坏，故选择分散气压0.20MPa用于粒度测定。

2.2.2 振动进样速度的考察

分散气压设置为0.20 MPa，测量时间10 s，振动进样速度分别设置为70%、80%和90%，进行粒度测定，结果见表2。

由表2可知，本品分散气压设置为0.20 MPa，振动进样速度分别为70%、80%和90%时，对粒度结果无明显影响，故选择振动进样速度80%用于粒度測定。

2.2.3 测量时间的考察

固定分散气压为0.20 MPa、 振动进样速度80%，考察测量时间分别为5、10和15s（背景时间与测量时间相同）条件下对测定结果的影响，结果见表3。

由表3可知，本品分散气压设置为0.20 MPa、振动进样速度80%，测量时间分别为5、10和15 s时，粒度结果无明显差异，故本品粒度测定的参数值初步定为：分散气压0.20 MPa、振动进样速度80%、测量时间10 s。

2.3 测定方法对比

2.3.1 机械筛分法

取本品30 g，置于250 μm孔径筛中，下层筛网孔径依次为235、180、150、125、90和75 μm，设置筛分次数1000次，筛分频率100次/min。取各药筛与接收容器，称定重量，根据筛分前后的重量差异计算各药筛上和接收容器内颗粒及粉末所占比例（%）。取与激光粒度法筛分图中给出的范围内体积（%）进行比较。非达霉素原料药粒径较小，颗粒之间有团聚作用，样品粘筛，难以通过筛孔，前后两次测量重量差异大于5%，测量误差大，无法与激光散射法进行比较。

2.3.2 显微镜法

取少量本品放置于载玻片上，选择200倍显微镜镜直接观察，调整多个视野统计计数粒子50个，取平均值作为该样品的粒度，结果见表4，与激光粒度法相比，两种方法测得的粒度结果没有显著差异。显微镜法虽简单快捷，但易受人为因素影响，且取样量少，代表性不强，只适合粒度分布范围较窄的样品。

2.4 测定方法确定

分析模式：通用模型；干法测定，标准文丘里管，样品折射率1.50，颗粒吸收率0.01，分散气压0.20 MPa，振动进样速度80%，背景和测定扫描时间10 s，遮光度范围0.5%～5.0%，每个试样重复测定2次，报告平均结果。

3 测定方法验证

根据ICH指南要求，典型的验证指标包括专属性、线性、范围、准确度、精密度、耐用性、检测限、定量限。但激光粒度测试不能区分样品中的不同组分，因此ICH定义的专属性是不适用的。激光粒度测试没有标准品，线性、检测限、定量限也不适用于激光粒度测试。USP<429>也未要求开展准确度验证[6]，因为对于非球形颗粒，不同测试仪器会给出不同的结论。因此，采用激光散射法对粒度进行测定常规的验证项目仅包括重复性、中间精密度、耐用性。

3.1 重复性试验

取非达霉素原料药样品，连续测定6次，统计样品的D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）的平均值及RSD，结果见表5。

由表5可知，D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）6次测量结果的RSD分别为1.25%、0.60%和0.75%，说明该方法重复性良好。

3.2 中间精密度试验

取非达霉素原料药样品，由不同试验人员，在不同时间，按“2.4”项下仪器参数进行测定，与“3.1”项下的6组数据一起计算相对标准偏差（RSD），结果见表6。

由表6可知，12组数据D（0.1），D（0.5），D（0.9）的RSD分别为1.14%、0.91%和2.39%，说明该方法中间精密度良好。

3.3 耐用性试验

分别考察分散气压（0.20±0.02） MPa、振动进样速度（80%±4%）微小变化对非达霉素原料药粒度测定结果的影响。

（1）在“2.4”项下仪器参数的基础上调整分散气压为0.18 MPa和0.22 MPa，分别测定3次，与“3.1”项下前3组数据计算相对标准偏差（RSD），结果见表7。

由表7可知，分散气压在（0.20±0.02） MPa范围内，9组数据D（0.1）、D（0.5）和D（0.9）的RSD分别为7.98%、7.01%和6.27%，说明该方法在此条件下耐用性良好。

（2）在“2.4”項下仪器参数的基础上调整振动进样速度为76%和84%，分别测定3次，与“3.1”项下前3组数据计算相对标准偏差（RSD），结果见表8。

由表8可知，振动进样速度在（80%±4%）范围内，9组数据D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）的RSD分别为1.41%、0.57%和1.88%，说明该方法在此条件下耐用性良好。

3.4 样品测定

按“2.4”项下确定的方法，测定6批非达霉素原料药的粒度，统计各批次样品的D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）的平均值及RSD，结果见表9。

结果表明，各批次样品的D（0.1）、D（0.5）、D（0.9） RSD值均小于2.5%，所建立的方法稳定可靠，可用于非达霉素原料药粒度的测定。

4 讨论

随着一致性评价的开展，原料药的粒度分布越来越受到制药业的重视。原料药粒度分布的不同，会导致颗粒流动性、可压性、溶解性的变化，从而导致制剂关键参数的改变。使用激光散射法测定样品粒度分布前，需要采用粒径分布特征值已知的“标准粒子”对仪器进行评价，平行测定5次“标准粒子”，其D（0.1）、D（0.5）、D（0.9）的均值与其特征值的偏差、RSD应符合《中华人民共和国药典》2020年版的要求；样品加入进样器时，需进行过筛操作，减少团聚对测定结果的影响。每次测定（尤其是粒度范围分布较宽的样品），样品量不宜过多，样品盘中残留的粉末过多，会导致取样不均因，影响数据的准确度；测定结束后，需要用微晶纤维素或甘露醇对测定管路进行清洗。

目前我国药企多用激光粒度仪对原料药粒度进行检测，但关于激光散射法测定药品粒度的方法验证，文献报道较少。USP <429>基于ISO13320-1（1999）标准和9276-1（1998）开发[6]，仅规定了重复性、中间精密度的相关要求。本研究依据ICH Q2（R1）及马尔文帕纳科公司培训资料，建立了激光散射法测定非达霉素粒度的方法，并在重复性和中间精密度试验的基础上增加了耐用性试验，使激光粒度测定方法的验证内容更科学和严谨。同时根据USP <429>，将方法学考察结果和样品测定结果的RSD标准设定为小于10%。

本研究所建立的粒度测定方法简洁易行，可用于非达霉素原料药的粒度测定和生产中的粒度质量控制，也可为易团聚原料药粒度测定方法的开发提供参考。

参 考 文 献

Hardesty J S， Juang P. Fidaxomicin： A macrocyclic antibiotic for the treatment of Clostridium difficile infection[J]. Pharmacotherapy， 2011， 31 （9）： 877-886.

Michael G， Grit A. OPT-80， a macrocyclic antimicrobial agent for the treatment of Clostridium difficile infections： A review[J]. Expert Opin Invest Drugs， 2008， 17（4）： 547-553.

国家药典委员会. 中华人民共和国药典[S]. （2020年版四部）. 北京： 中国医药科技出版社， 2020： 通则982.

谷广志， 王也牧， 刘蔚， 等. 依非韦伦原料药粒度的激光散射法测定[J]. 中国医药工业杂志， 2016， 47（1）： 67.

邓银来， 徐静， 吴晓明. 激光散射法测定替格瑞洛原料药的粒度分布[J]. 中国药物评价， 2017， 34（3）： 171.

The United State Pharmacopeial Convention.U.S. Pharmacopeia/National Formulary[S]. （USP NF 2022）. The United State Pharmacopeial Convention Press， 2022： General Chapter 429.

收稿日期：2023-01-30

基金项目：河北省科技研发平台建设专项（No. 22567651H）

作者简介：孙超，男，生于1984年，硕士，工程师，从事药物制剂开发工作，E-mail： sunchao1984@hotmail.com

*通信作者，E-mail： gfr78@163.com