青蒿素抑制星形胶质细胞炎症通路的分子机制研究

张书滔　童宇　郭小岚　陈俊希　许光亚　唐勇　郑露露　时政

摘要：目的 分別以P2X7、外泌体以及瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）为作用靶点，研究青蒿素（ART）抑制星形胶质细胞炎症通路的分子机制。方法 培养小鼠原代星形胶质细胞，利用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫荧光鉴定原代星形胶质细胞的纯度；MTT法检测ART对细胞活性的影响；脂多糖（LPS）处理原代星形胶质细胞，构建细胞炎症模型；分为空白对照组，ART组，外泌体抑制剂组，P2X7受体抑制剂组，TRPV1受体抑制剂组，TRPV1受体激动剂组，通过ELISA法和吸光光度法检测细胞上清液中炎症因子的含量（TNF-α、IL-1β、IL-6及NO）。结果 GFAP阳性细胞数达95%表明成功分离培养小鼠原代星形胶质细胞；300 ng/mL的LPS处理12 h是刺激星形胶质细胞构建炎症模型的最佳浓度和时间；10 μmol/mL的ART处理12 h 可以达到最佳的抗炎效果，并且当浓度小于20 μmol/mL时，对细胞活性基本无影响；抑制P2X7受体的表达和外泌体的释放均能降低细胞中炎症因子TNF-α的含量，但不能与ART产生协同降低的效果；抑制TRPV1受体增加了细胞中的TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO表达，激活TRPV1受体可降低TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO表达，并且ART与TRPV1受体激动剂合用时，能协同降低炎性因子表达。结论 青蒿素除了已知的通路发挥其抗炎作用之外，还有可能通过TRPV1通路发挥其抗炎作用。本研究为青蒿素发挥抗炎作用的分子机制提供了新的方向。

关键词：神经炎症；青蒿素；星形胶质细胞；P2X7；外泌体；TRPV1

中图分类号：R285.5文献标志码：A

The preliminary molecular mechanism study of artemisinin inhibit astrocytes inflammatory pathway

Zhang Shutao1， Tong Yu1， Guo Xiaolan1，Chen Junxi1， Xu Guangya2， Tang Yong3， Zheng Lulu4， and Shi Zheng1

（1 School of Clinical Medicine， Affiliated Hospital of Chengdu University， Chengdu 610106; 2 School of Basic Medicine of Chengdu University， Chengdu 610106; 3 School of Health and Rehabilitation of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 610075; 4 College of Food and Bioengineering of Chengdu University， Chengdu 610106）

Abstract Objective To investigate the molecular mechanism of artemisinin （ART） inhibiting the inflammation pathway of astrocytes by targeting P2X7， exosomes and transient receptor potential vanilic acid subtype 1 （TRPV1）. Methods Mouse primary astrocytes were cultured， and the purity of primary astrocytes was determined by GFAP immunofluorescence. The effect of ART on cell activity was detected by MTT assay. Primary astrocytes were treated with lipopolysaccharide （LPS） to construct a cellular inflammation model. They were divided into blank control group， ART group， exosome inhibitor group， P2X7 receptor inhibitor group， TRPV1 receptor inhibitor group and TRPV1 receptor agonist group. The contents of inflammatory factors （TNF-α， IL-1β， IL-6 and NO） in cell supernatant were detected by ELISA and absorbance spectrophotometry， then determine the best anti-inflammatory effect of each group. Results The number of GFAP positive cells was 95%， indicating that the primary mouse astrocytes were successfully isolated and cultured 300 ng/mL LPS treatment for 12 h was the best concentration and time to stimulate astrocytes to construct the inflammatory model.10 μmol/mL ART for 12 h can achieve the best anti-inflammatory effect， and when the concentration is less than 20 μmol/mL， there is no effect on the cell activity. Inhibition of P2X7 receptor expression and release of exosomes can decrease the content of inflammatory cytokine TNF-α in cells， but cannot produce synergistic effect with ART. Inhibitor of TRPV1 receptor increased the expression of TNF-α， IL-1β， IL-6 and NO in cells， and activation of TRPV1 receptor could decrease the expression of TNF-α， IL-1β， IL-6 and NO. ART combined with TRPV1 receptor agonist could cooperatively reduce the expression of inflammatory factors. Conclusion Artemisinin may exert its anti-inflammatory effect through TRPV1 pathway besides known pathways. This study provides a new direction for the molecular mechanism of artemisinin's anti-inflammatory effect.

Key words Neuroinflammation; Artemisinin; Astrocytes; P2X7; Exosomes; TRPV1

神经炎症是由中枢神经系统（CNS）中的固有的免疫细胞（小胶质细胞和星形胶质细胞）激活的免疫应答[1]。通常，在CNS损伤、感染、毒素的刺激下或在自身免疫的作用下会出现神经炎症。神经炎症与中枢神经系统疾病的发生发展有着密切的联系，如：阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症和多发性硬化等神经退行性疾病[2]。星形胶质细胞是哺乳动物大脑中含量最多的神经胶质细胞，其除了传统的对神经元起支持作用和血脑屏障成分外，还参与调节局部血流量、脑代谢、离子稳态和氧化应激等过程[3]。星形胶质细胞在受到损伤后，形态与功能发生变化形成反应性星形胶质细胞，其不仅产生促炎细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IFN-γ，同时增加活性氧（ROS）的产生，加重炎症反应过程，导致神经退化甚至凋亡坏死，从而启动和促进炎症反应[4]。因此，星形胶质细胞是神经免疫系统中重要的靶细胞。

青蒿素（ART）是从复合花序植物黄花蒿茎叶中提取的有过氧基团的倍半萜内酯的一种无色针状晶体，经化学改造后可生产多种不同的衍生物[5]，如双氢青蒿素、青蒿琥酯、SM905和SM933等。青蒿素及其衍生物除了具有抗疟作用外，还具有强效的抗炎、抗真菌、抗肿瘤和免疫调节等广泛的药理学活性[6]。值得注意的是， 越来越多的证据表明，ART可以作为治疗炎症药物， 通过作用于炎症过程治疗中枢神经系统（CNS）疾病。研究表明ART可以在小胶质细胞中通过减少炎症介质的产生，增加IκB-α的表达，从而阻断NF-κB转移到细胞核上，进而抑制脂多糖（LPS）诱导的炎症反应[7]。双氢青蒿素通过调节PI3K/AKT的磷酸化和下调炎症因子IL-1β和IL-6明显减轻了LPS诱导的抑郁样行为和认知功能障碍[8]。

瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）作为配体门控的非选择性阳离子通道，是瞬时受体点位（TRP）蛋白中最具特征的成员。越来越多的证据表明，TRPV1与免疫反应密切相关，被认为是大多数癫痫发作和神经退行性疾病的神经炎症中的分子开关[9]。其广泛分布于哺乳动物的感觉神经纤维中，在非神经细胞如胶质细胞、单核细胞中也存在[10]，与神经源性疼痛和炎症的发生密切相关，可以被多种神经炎症介质如缓激肽、前列腺素、ATP、神经生长因子（NGF）等直接或间接激活，释放P物质、CGRP等多种神经肽类物质，参与TNF-α的致炎过程、诱导神经源性炎症等病理过程[11]。P2X受体是一种非选择性的ATP门控阳离子通道，其被激活后，使细胞膜对阳离子更加通透，引起质膜去极化，从而导致了一系列的生理或病理变化。近年来，P2X7受体在神经炎症的形成与进展调控作用备受关注。王珏等[12]通过小鼠实验证明，在炎症等病理情况下，局部细胞可释放大量ATP和降解产物，这些物质浓度的升高可达到激活小胶质细胞的水平，其中BV-2（小鼠小胶质细胞）细胞的P2X7的表达升高最为强烈，小胶质细胞再进一步释放促炎因子加重神经系统的损伤，通过基因层面降低P2X7的过表达可能有效抑制神经性炎症反应。同时，TRPV1与P2X受体两者之间存在一定的联系，背根神经节（DRG）的卫星胶质细胞中的P2X7受体参与了TRPV1介导的糖尿病神经病理痛（DNP）的过程，并且涉及炎症反应，由p38和ERK信号通路介导[13]。外泌体（exosome）是细胞外囊泡的一个亚组，大小从30到100 nm不等，由不同的细胞类型释放[14]。研究表明星形胶质细胞释放的外泌体可以将错误折叠的病原蛋白和/或异常表达的miRNA转运到神经元中，然后作用引发或传播神经炎症[15]，且星形胶质细胞外泌体能够干预JAK2/STAT3通路从而抑制小胶质细胞介导的炎症反应和凋亡途径，来缓解癫痫大鼠小胶质细胞活化介导的神经炎性损伤及凋亡，發挥神经系统的保护作用[16]。综上所述，P2X7、TRPV1和外泌体均参与了星形胶质细胞介导的神经炎症反应，但青蒿素是否通过这3个受体发挥抗中枢炎症的机制尚不清楚。

因此，本文拟通过原代星形胶质细胞的培养及鉴定、炎症模型的建立、青蒿素抗炎作用浓度时间的考察以及P2X7、外泌体和TRPV1对青蒿素抗炎作用的影响，从而研究P2X7、TRPV1和外泌体在青蒿素抑制LPS刺激原代星形胶质细胞炎症方面的作用，为青蒿素的在抗炎作用的分子机制提供更多实验证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用出生24～48 h的昆明新生小鼠，母体生殖期间均自由进食饮水，环境温度和湿度分别维持在25 ℃和60%左右，自然节律光照。本实验规程及方案符合成都大学动物伦理审查标准。

1.2 试剂和耗材

基础高糖培养基、胎牛血清、双抗青霉素-链霉素（美国Hyclone公司）；牛血清白蛋白、Triton X-100、A438079（P2X7受体拮抗剂）、GW4869（外泌体抑制剂）（美国Sigma-Aldrich公司）；Capsaicin（辣椒素，TRPV1受体激动剂）、Capsazepine（辣椒平，竞争性TRPV1受体拮抗剂）（英国Tocris Bioscience公司）；Mouse TNF-α ELISA Kit、Mouse IL-6 ELISA（北京四正柏生物科技有限公司）、Mouse IL-1β ELISA Kit（杭州联科生物技术股份有限公司）、一氧化氮（NO）测定试剂盒（酶法）（南京建成生物工程研究所）；青蒿素（批号：A0114，成都曼思特生物科技有限公司）。

1.3 小鼠原代星形胶质细胞的培养

取出生24～48 h的新生乳鼠的全脑，剥离整个脑组织，将脑组织完整取出于解剖显微镜下小心剥离脑膜和血管，并使用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液清洗后将组织剪碎成糜状的组织块，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶，在37 ℃的细胞培养箱中消化30 min后，取等量含10%胎牛血清的培养基终止消化。离心（15 min， 1000 r/min， 4 ℃），弃上清液，加入适量10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基轻柔缓慢吹打细胞，制备单细胞悬液接种于6孔培养板。培养第2天放置于恒温摇床中200 r/min震摇2 h。

1.4 鼠原代星形胶质细胞的鉴定

待细胞处于对数生长期时，取出爬片，先加入磷酸缓冲液清洗3次，每次5 min，随后加入4%的多聚甲醛固定液，固定15 min。固定结束后，用磷酸缓冲液清洗3次，清洗时间依次为10、5和5 min。用5% BSA+ 0.3% Triton X-100于37 ℃孵箱中孵育1 h。吸走封闭液，加入一抗，4 ℃过夜结束后，在避光环境中，用磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min，清洗好后，加入二抗，37 ℃孵箱孵育1 h。磷酸缓冲液清洗3次，每次10 min，加入15 μL的4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI），室温避光静置5 min，磷酸缓冲液漂洗5 min，吸干液体，再加入10 μL防淬灭剂，防止荧光剂的淬灭，置荧光显微镜下观察。

1.5 LPS炎症细胞模型的建立

将对数生长期的小鼠星形胶质细胞以1×105个的密度接种于96孔板中，在培养箱培养24 h，待细胞贴壁形态正常后，分为对照组、LPS不同浓度组（100、200、300、600和1000 ng/mL的LPS处理12 h）、LPS时间干预组（300 ng/mL的LPS处理0、3、6、12和24 h）。采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中TNF-α水平。

1.6 青蒿素对LPS诱导的炎症细胞活性的影响

将对数生长期的小鼠星形胶质细胞以1×105个的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁形态正常后，分为调零组（无细胞，仅加培养基）、空白对照组（有细胞，有培养基，不加药）、生理状态ART组（ART浓度分别为5、10、20、40、80 μmol/mL）、病理状态ART组，边缘孔以磷酸缓冲液填充，作用12 h，每组设置6个复孔。12 h后，去除培养基，每孔加入100 μL 5 ng/mL的MTT，放置培养箱孵育2 h后，吸出MTT 溶液，每孔加入100 μL DMSO，然后使用酶标仪检测490 nm波长处吸光度值。细胞存活率（%）=（A实验组－

A调零组）/ （A对照组－A调零组）×100%。

1.7 青蒿素抗炎作用浓度和时间的考察

实验分为空白对照组、DMSO组、模型组（300 ng/mL的LPS）、ART不同浓度组（5、7、9、10、20、40和80 μmol/mL的ART处理12 h）、ART不同时间组（10 μmol/mL的ART分别处理0、3、6、12和24 h），每组设置6个复孔。采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中TNF-α水平，考察ART最佳的抗炎作用浓度和时间。

1.8 青蒿素对外泌体、P2X7以及TRPV1受体的影响

实验分为空白对照组、DMSO组、模型组

（300 ng/mL的LPS）、治疗组（LPS+DMSO；LPS+

10 μmol/mL ART；LPS+10 μmol/mL GW4869（外泌体抑制剂）；LPS+10 μmol/mL ART+10 μmol/mL GW4869；LPS+10 μmol/mL A438079（P2X7抑制剂）；LPS+10 μmol/mL ART+10 μmol/mL A438079；LPS+10 μmol/mL Capsazepine（辣椒平，竞争性TRPV1拮抗剂）；LPS+10 μmol/mL ART+10 μmol/mL

Capsazepine）。采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中TNF-α水平，考察ART对外泌体、P2X7以及TRPV1受体的作用。

1.9 青蒿素对TRPV1受体的影响

将对数生长期的小鼠星形胶质细胞以1×105个/孔的密度接种于96孔板中，待细胞贴壁形態正常后，分为空白对照组、DMSO组、模型组（300 ng/mL的LPS）、空白药物组（10 μmol/mL的capsaicin（辣椒素，TRPV1受体激动剂）；10 μmol/mL （capsazepine）、治疗组（LPS+DMSO；LPS+10 μmol/mL ART；

LPS+10 μmol/mL capsazepine；LPS+10 μmol/mL

ART+10 μmol/mL capsazepine；LPS+10 μmol/mL

capsaicin；LPS+10 μmol/mL ART+10 μmol/mL capsaicin）。采用酶联免疫吸附法检测细胞上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平。由于NO的化学性质相当的活泼，它在体内代谢会转化成为亚硝酸盐（NO2﹣）和硝酸盐（NO3﹣），而亚硝酸盐又会进一步被转化成为硝酸盐，因此，本实验是利用硝酸还原酶将硝酸盐特异性地还原成为亚硝酸盐，然后再通过显色深浅从而测定细胞上清液中浓度的高低：NO含量=（测定A值－空白A值）/（标准A值－空白A值）×标准品浓度（100 μmol/mL）。

1.10 统计学处理

数据用均值±标准差（x±s）表示，当P<0.05时，认为数据有统计学意义。在多组组间的比较采用的是单因素方差分析（one-way Anova）；在组内两两比较采用的是配对检验，整个数据采用GraphPad Prism7作图统计分析。

2 结果

2.1 小鼠原代星形胶质细胞的鉴定结果

采用GFAP免疫荧光对原代培养的小鼠细胞进行染色，结果如图1，培养的星形胶质细胞胞浆和突起被染成红色，随机选择5个位置计数，计算GFAP染色和DAPI染色的比例的平均值，计算出GFAP阳性细胞数达95%，可用于后续实验。

2.2 LPS炎症细胞模型的建立

通过检测细胞培养上清液中炎症因子TNF-α的水平探讨LPS炎症细胞模型的最佳构建条件。结果如图2，300 ng/mL的LPS处理12 h时，TNF-α浓度最高，继续增加LPS浓度和作用时间，TNF-α的浓度不能显著升高。故用300 ng/mL的LPS处理12 h是刺激星形胶质细胞构建炎症模型的最佳浓度和时间。

2.3 青蒿素对细胞活性的影响

MTT实验的结果如图3，当ART浓度为5 μmol/mL和10 μmol/mL时，对生理状态和病理状态的原代星形胶质细胞的活性并无显著影响，但当继续增加ART浓度时20 μmol/mL时，开始抑制原代星形胶质细胞的活性。

2.4 青蒿素抗炎的最佳浓度和时间

ART浓度为7 μmol/mL时表现出抗炎活性，在浓度为10 μmol/mL处理12 h时发挥出最好抗炎效应，然而继续增加ART的浓度和作用时间，抗炎效应不能持续增长。因此，10 μmol/mL ART干预12 h为抑制LPS刺激的原代星形胶质细胞分泌TNF-α浓度的最佳浓度和时间（图4）。

2.5 青蒿素对外泌体、P2X7以及TRPV1受体的影响结果

分别用ART、A438079（P2X7抑制剂）和GW4869（外泌体抑制剂）均能降低细胞上清液中TNF-α的浓度，但是ART分别与A438079和GW4869合用时并未协同降低TNF-α的浓度（图5A、B）。由此推测出ART的抗炎作用靶点不是P2X7受体和外泌体。单独使用ART时，可以降低TNF-α的浓度，而单独使用capsazepine会升高细胞上清中TNF-α的浓度，合并使用ART和capsazepine时，青蒿素并未发挥出抑制TNF-α浓度的能力，推测ART发挥抑制TNF-α浓度的作用可能是通过TRPV1受体，因TRPV1受体被抑制，从而不能发挥出ART对TNF-α的抑制作用（图5）。

2.6 青蒿素对TRPV1受体的影响结果

在LPS诱导的星形胶质细胞炎症模型中，单独使用ART和capsaicin均能降低细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO的浓度，而capsazepine却升高了星形胶质细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO的浓度。以上研究表明，ART与capsaicin都能抑制LPS致炎的星形胶质细胞炎症，而capsazepine不能抑制，当ART和capsaicin以及capsazepine联合使用去干预LPS致炎的星形胶质细胞时。有趣的是，ART无法降低capsazepine组的炎症因子。结果说明：ART可能通过激活TRPV1受体，引起细胞释放多种神经肽，从而发挥抗炎作用（图6）。

3 讨论

神经炎症是各种神经系统疾病（包括神经退行性疾病和中枢神经系统损伤）的关键因素[17]。在本研究中发现ART的确具有良好的抗炎活性，并且通过激动TRPV1受体，抑制星形胶质细胞中促炎因子：TNF-α、IL-1β、IL-6以及NO的释放，从而发挥其抗炎作用，本研究为青蒿素发挥抗炎作用的分子机制提供了新的方向。

尽管ART在多种信号转导过程的调节中发挥着不同的作用[18-19]，但迄今为止，这些途径中的分子机制仍然需要进一步研究。Kim等[20]通过体外实验中发现，尽管ART干预对淀粉样β（Aβ）纤维的形成没有影响，但ART确实可以减轻APPSWE/PS1dE9转基因小鼠神经炎症负担[21]。另外，ART可以通过抑制NF-κB核易位和细胞溶质固有免疫信号受体NOD-和LRR-结构域从而抑制β-分泌酶切割淀粉样蛋白前体蛋白（APP）和炎症反应，发挥治疗阿尔兹海默症的作用[22]。

ART及其衍生物除了减轻中枢神经系统的炎症反应外，还可有效治疗全身炎症病[23-24]。因此，ART可以是开发阿尔兹海默和其他神经退行性疾病治疗或预防策略的潜在候选药物。

P2X7受体与其余嘌呤信号受体P2X受体具有不同的药理学特性[25]。P2X7受体在组织损伤、感染或在肿瘤微环境等伴随炎症的条件下可被激活，实际上，P2X7受体长期激活后，可形成允许分子量大于900 Da的亲水性物质通过的孔道，这种孔道的形成可导致炎性小体的激活[26]。炎性小体主要是通过裂解方式使蛋白酶，caspase-1，前体白细胞介素分子形成IL-1β和IL-18，随后释放到胞外产生炎症[27]。研究表明，P2X7受体在多种炎性病理状态下表达上调，并可影响炎性介质的表达和释放，参与炎性反应和免疫反应，诱导细胞损伤甚至凋亡等过程。本课题证实了P2X7抑制剂确实可以通过抑制P2X7受体，从而降低LPS致炎的原代星形胶质细胞上清液中TNF-α的浓度，能够在一定程度上减轻炎症反应，但是，P2X7受体抑制剂并不能和ART一起协同作用降低原代星形胶质细胞上清液中TNF-α的水平。

外泌体和炎症之间也有紧密的联系，不同类型的免疫细胞在识别外来刺激后，会分泌出发生改变的外泌体[28]。当受到LPS刺激时，巨噬细胞分泌的外泌体水平增加，蛋白质含量增加，并可诱导巨噬细胞中TNF-α和IL-6的产生[29]。另一方面，免疫细胞也可以作外泌体的受体细胞，触发炎症反应。有研究证明急性结肠炎小鼠的血清中的外泌体，可以上调MAPK信号转导和释放TNF-α[30]，促进炎症的发生和发展。因此，可以得出结论，免疫细胞主动分泌的外泌体也在炎症过程的调节中发挥重要作用。本实验也证实了可以通过抑制外泌体的释放从降低了而LPS致炎的原代星形胶质细胞上清液中TNF-α的水平，但是在外泌体抑制剂和ART共同作用的分组中，并没有体现出协同作用。从本实验中发现ART并没有通過抑制外泌体的释放从而发挥抗炎作用。

TRPV1可能通过调节胶质细胞的活性来调节神经炎症。在碘乙酸钠诱导的炎性痛大鼠模型中，TRPV1拮抗剂可有效抑制诱发痛及自发痛，且TRPV1抑制剂可降低脑组织等部位中SP、CGRP等神经肽的表达，从而减轻神经源性炎症程度[31]。但是，其对星形胶质细胞中的影响的研究还较少。在经过前期对外泌体、P2X7受体的研究后，进行了TRPV1受体在ART抑制LPS介导的原代星形胶质细胞炎症中的作用，然而体外培养的原代星形胶质细胞得到的却是不一样的结果：TRPV1抑制剂capsazepine不能够降低体外培养的原代星形胶质细胞上清液中的TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的水平，且capsazepine和LPS升高的炎性因子水平无法被ART所降低，而TRPV1激动剂Capsaicin反而能够和ART一起协同降低LPS致炎的体外培养的原代星形胶质细胞上清液中的炎性因子水平。这表明，capsaicin、capsazepine和ART与TRPV1受体之间的关系并不那么简单，三者之间相互作用关系还值得更深入的研究。免疫系统和神经系统之间的相互作用与小胶质细胞和星形胶质细胞中促炎性细胞因子的产生有关，这些细胞因子构成中枢神经系统炎症介质的主要来源[32]。由此可见，ART除了已知的通过NF-κB发挥其抗炎作用之外，可能激动TRPV1受体发挥抗炎作用。本研究为ART发挥抗炎作用的分子机制提供了新的方向。

参 考 文 献

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收稿日期：2022-12-28

基金项目：成都大学临床医学院附属医院创新团队项目（No. CDFYCX202208）；四川省科技厅农业科技成果转化资金项目（No. 2022NZZJ0015）；四川省2021—2023年高等教育人才培养质量和教学改革项目（No. JG2021-1103）；龙泉驿英才计划C类创新人才计划 （No. 90）；成都大学附属医院院级课题（No. Y202232和No. Y202234）

作者简介：张书滔，男，生于2000年，主要研究方向为神经疾病的中西医康复治疗，E-mail： Shutao0731@163.com

*通信作者，E-mail： drshiz1002@hotmail.com