CHST家族在临床无功能腺瘤组织中的表达及意义*

董晓柳,董 伟,陈玉娟,张 于,张 利,张 欢

(唐山市人民医院:1.神经康复科;2.神经外科;3.神经内科;4.重症医学科,河北唐山 063000)

垂体腺瘤是起源于垂体前叶的肿瘤,约占颅内原发肿瘤的第二位,按照临床症状和血清激素水平,可以分为功能性腺瘤和无功能腺瘤。第5版世界卫生组织内分泌和神经内分泌肿瘤的分类指南提供了基于肿瘤细胞谱系、垂体激素类型和相关特征的详细组织学分类[1]。虽然该指南有利于患者的个性化诊疗,但是这种高度复杂的分类方式也给临床工作带来巨大的压力和困惑。碳水化合物硫转移酶(carbohydrate sulfotransferase,CHST)家族与肿瘤发生密切相关[2-3],参与细胞黏附、信号转导和免疫反应等多个生物学过程[4-5]。文献报道CHST家族参与胰腺癌进展,CHST7启动子甲基化状态与垂体腺瘤的增殖和分化有关[6-7]。本研究拟在90例临床无功能腺瘤患者中检测CHST家族成员的基因表达水平,明确其表达水平与临床特征、肿瘤谱系分化的关系,以期为临床无功能腺瘤未来的分类及治疗提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料

标本来源于2019年1月至2022年10月唐山市人民医院神经外科手术切除的90例临床无功能腺瘤患者,用于检测患者肿瘤组织的CHST1、CHST2、CHST7和CHST8基因水平及开展临床特征相关性分析。其中男59例(65.6%),女31例(34.4%);年龄21～75岁,平均(51.34±1.16)岁;肿瘤体积1.09～35.88 cm3,平均(8.12±0.79)cm3。本研究将Knosp分级Ⅲ～Ⅳ级定义为侵袭,Knosp分级Ⅰ～Ⅱ级及Ki-67指数<3%定义为非侵袭,其中侵袭组35例,非侵袭组55例;将Ki-67指数≥3%定义为高增殖,<3%定义为低增殖,其中高增殖组23例,低增殖组67例。本研究获得唐山市人民医院伦理委员会批准(审批号:RMYY-LLKS-2022-021),患者或家属均签署知情同意书。

1.2 试剂与材料

RNA抽提试剂盒购自凯杰企业管理(上海)有限公司,反转录试剂盒和实时荧光定量试剂盒购自美国Thermo公司;引物由北京合生基因科技有限公司合成;DAB购自北京中山金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1反转录实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测肿瘤标本中CHST1、CHST2、CHST7、CHST8和TBX19、POU1F1、SF-1的基因水平

每个标本取10 mg左右的组织,利用一步法提取细胞总RNA,反转录合成cDNA。以cDNA为模板进行qPCR反应。PCR扩增条件为50 ℃ 20 min,95 ℃ 10 min;95 ℃ 10 s、60 ℃ 1 min,40个循环。引物序列如下:CHST1正向引物为5′-CCT CTT TGA CCT CAC CCC TT-3′,反向引物为5′-CAG GTG TGA AAG GAC TTG GC-3′;CHST2 正向引物为5′-AGA CCT GAT TCC CTG TGG TG-3′,反向引物为5′-GCA AAG AAG AAG AGG GGC AC-3′;CHST7 正向引物为5′-GAT TTC TTC CTG ACC GGT GC-3′,反向引物为5′-GAG TCA TGT TGA GCG CGA AG-3′;CHST8 正向引物为5′-CAG CAC CTA CAC CAA GAT GC-3′,反向引物为5′-TCC CAG TGA ATG TCC ATC CC-3′;TBX19正向引物为5′-GTA TCT TCT CTC CGC TCC CC-3′,反向引物为5′-CTG AAG CTC ACT CTC CAC CA-3′;POU1F1 正向引物为5′-TCC TGA CCA CAC CTT GAG TC-3′,反向引物为5′-GCC TCC CCA ACA TTT GTC TG-3′;SF-1 正向引物为5′-TCT GAG TAC CCG GAG CCT TA-3′,反向引物为5′-TGG AGA TGA AGG TCT GGT CG-3′;内参基因GAPDH正向引物为5′-CCA AGG AGT AAG ACC CCT GG-3′,反向引物为5′-TGG TTG AGC ACA GGG TAC TT-3′。以2-ΔΔCt表示标本中受检基因mRNA的相对表达水平。

1.3.2免疫组织化学染色检测肿瘤标本中POU1F1编码蛋白PIT1、SF-1和TBX19编码蛋白TPIT的染色水平

肿瘤组织以10%中性甲醛固定,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋,5 μm厚度连续切片。烤箱60 ℃烤片1 h,梯度脱蜡,抗原修复后以羊血清封闭30 min,滴加PIT1、SF-1和TPIT一抗,4 ℃孵育过夜,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer,PBS)冲洗3次,二抗室温孵育1 h,PBS冲洗3次,DAB显色后自来水冲洗,苏木素复染,梯度脱水,二甲苯透明,中性树胶封固,显微镜下拍照观察封片。(1)阴性:阳性细胞数≤1%;(2)弱阳性:阳性细胞数>1%～5%;(3)阳性:阳性细胞数>5%。

1.4 统计学处理

2 结 果

2.1 垂体腺瘤的CHST家族的表达水平

RT-qPCR结果显示,CHST1基因表达水平是(8.700±1.300)×10-3,CHST2基因表达水平是(0.060±0.010)×10-3,CHST7基因表达水平是(0.026±0.004)×10-3,CHST8基因表达水平是(0.320±0.028)×10-3。体积大的肿瘤CHST1基因和CHST7基因表达水平高于体积小的肿瘤(P=0.014,P=0.044),女性患者CHST2基因表达水平高于男性患者,侵袭性肿瘤的CHST8基因表达水平低于非侵袭肿瘤(P=0.044),见表1。

表1 90例临床无功能腺瘤中的CHST家族基因表达水平

相关性分析显示,CHST1基因表达水平与肿瘤体积的相关系数(r)是0.321(P=0.002),CHST7基因表达水平与肿瘤体积的相关系数是0.426(P<0.001);CHST家族基因水平与患者年龄无关,见表2。

表2 CHST家族基因表达水平与肿瘤体积的相关性分析

2.2 CHST家族表达水平与垂体腺瘤谱系分化有关

按照转录因子染色强弱分为3组;与SF-1阴性相比,SF-1阳性或弱阳性患者具有较高的CHST1和CHST8基因表达水平,具有较低的CHST7基因表达水平(P<0.05);与PIT1阴性相比,PIT1阳性或弱阳性患者具有较高的CHST1基因表达水平,具有较低的CHST2基因表达水平(P<0.01),见表3。

表3 不同PIT1和SF-1染色强度的CHST家族基因表达水平

相关性分析显示,CHST1水平与POU1F1水平呈正相关(r=0.686,P<0.001),与NR5A1水平呈负相关(r=-0.227,P=0.032);CHST7水平与POU1F1水平呈正相关(r=0.774,P<0.001);CHST8与FSHb、NR5A1水平呈正相关(r=0.485,P<0.001;r=0.725,P<0.001)。CHST家族的基因表达水平均与转录因子TBX19的水平无关(P>0.05),见表4。

表4 CHST家族基因表达水平与谱系分化相关转录因子的相关性分析

2.3 CHST家族在预测无功能腺瘤谱系分化中的诊断价值

在受试者工作特征(ROC)曲线分析中,预测未成熟POU1F1谱系,POU1F1、CHST1和NR5A1的ROC曲线下面积(AUC)分别为0.945(P<0.001)、0.750(P=0.023)和0.270(P=0.036);预测SF-1谱系,NR5A1、FSHb和CHST8的AUC分别为0.861(P=0.001)、0.823(P=0.002)和0.776(P=0.008)。CHST1和CHST8联合预测SF-1谱系的AUC为0.823(P=0.002),见图1和表5。

表5 CHST家族在预测无功能腺瘤谱系分化中的诊断价值

A:POU1F1谱系;B:SF-1谱系。

3 讨 论

垂体腺瘤是一种慢性、复杂的全身性疾病,发病机制复杂[8],主要影响下丘脑-垂体-靶器官轴[9],居颅内原发肿瘤的第二位,占原发性中枢神经系统肿瘤的17%[10],约35%的垂体腺瘤呈侵袭性生长[11]。多数垂体腺瘤具有较强的分泌功能,能使血液中激素水平升高,并产生相应的临床症状。但也有一些垂体腺瘤并不升高血液中的激素水平,也无激素过多症状,称为临床无功能垂体腺瘤,该类腺癌易导致诊断和治疗延误。2017年世界卫生组织发布了新的垂体肿瘤分型指南[12],其中垂体相关转录因子的表达情况被作为新的分型指标,为垂体腺瘤的诊治提供新依据、新方法[13]。

按照第5版世界卫生组织分类指南,正常腺垂体共由3个谱系共计6种腺细胞组成。基于转录因子PIT1、TPIT和SF1谱系定义的PitNETs分类和亚型具有明显的形态学、分子生物学和临床表型差异[14]。按照新版分类,临床无功能腺瘤包括未成熟PIT1谱系肿瘤、未成熟TPIT谱系肿瘤和SF-1谱系肿瘤,并且未成熟PIT1和TPIT谱系具有较高的侵袭性、无病生存时间短和复发率高的特点。本研究发现CHST家族与垂体腺瘤的增殖和侵袭有关,相关性分析明确CHST1、CHST7、CHST8与临床无功能腺瘤未成熟PIT1和SF-1谱系分化方向有关,初步确定CHST1和CHST8联合具有预测谱系分化的诊断价值。

临床无功能腺瘤占垂体腺瘤患者的15%～37%,发病率为(13.4～25.2)/10万人[15],通常表现为肿瘤压迫引起的继发症状,包括头痛、视力下降、视野缺损及垂体功能低下引起的一系列症状[16-17]。手术是无功能腺瘤首选的治疗方法,手术全切率为60%～73%[18]。大多数垂体腺瘤为良性,通过手术、药物治疗及放疗可治愈,但仍有约10%的垂体腺瘤表现有极高的侵袭性,且传统治疗方式无效,因此针对垂体相关转录因子的干预或许能成为一种新的治疗方式[19]。

硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)通过驱动癌基因表达,在肿瘤发生发展中发挥重要作用[20-21]。CSPGs可能通过细胞外基质(ECM)重构中参与了下丘脑-神经垂体系统的结构可塑性[22]。CHST家族负责将糖蛋白中的硫酸盐转移到碳水化合物上,并通过控制CSPGs的生物合成参与致癌性[23-25]。既往研究表明,CHST7高甲基化与垂体腺瘤SF-1谱系分化有关,CHST7低甲基化与垂体腺瘤PIT1谱系和TPIT谱系分化有关。本研究结果显示,CHST1和CHST7促进肿瘤增殖,CHST8与肿瘤侵袭有关。这一结果与未成熟PIT1谱系肿瘤具有较高侵袭性这一结论一致。

新版指南建议病理科对所有的垂体肿瘤患者至少进行3类12个指标的检测:(1)3个转录因子染色;(2)7种垂体激素染色;(3)雌激素受体α和GATA结合蛋白3。根据病理结果,新版指南将垂体肿瘤分为12种亚型,这种高度复杂的分类方式也给临床工作带来巨大的压力。本研究发现CHST1具有预测未成熟PIT1谱系的诊断价值,CHST8具有预测SF-1的诊断价值。CHST1和CHST8联合诊断价值与指南推荐的促卵泡激素β亚基相似。

综上所述,CHST家族与临床无功能腺瘤的谱系分化有关,单独检测CHST1、CHST1和CHST8联合检测是诊断未成熟PIT1和SF-1谱系分化的有效方法。遗憾的是,本研究入组的病例未包含未成熟TPIT谱系,仅数例散在的TPIT阳性病例,未能完全证实CHST家族与TPIT谱系肿瘤分化无关。