根际与根内细菌非同步响应玉米连作效应研究

甫文疆，赵芸晨

（1 河西学院农业与生态工程学院，甘肃张掖 734000；2 西北农林科技大学资源与环境学院，陕西杨凌 712100）

甘肃省张掖市位于河西走廊中部，因其独特的地理位置与自然环境，已发展成为全国最大的玉米种子生产基地，目前每年为全国70%以上玉米主栽区提供优良的种质资源[1]。但在现有资源条件下地块间竞争激烈，连作现象普遍发生。诸多研究表明，长期连作会加剧土壤环境恶化，加重土传病害的发生，影响制种玉米生产的进程，造成产量和品质下降[2-3]。连作障碍严重制约我国制种玉米生产的发展，已成为我国玉米制种业可持续发展的难题之一。

细菌是土壤环境中重要的微生物类群，连作会导致土壤细菌群落结构的动态平衡被打破，有益微生物减少，病原微生物增加，加剧了土传病害的发生，进而会阻碍作物生长[4-5]。根际微生物作为土壤生态系统的重要组成部分[3]，对外界环境变化十分敏感，在一定程度上可以衡量土壤质量和健康程度[6-7]。内生菌是生活史某一阶段或整个阶段生活在植物体内，不会引发植物明显病害症状，与植物互利共生的一类微生物；作为植物微生态系统的重要组成成员，被称为植物“第二基因组”，可维持植物体内微生态的平衡，保障植物健康生长[8]。近年来，随着高通量测序技术的发展，土壤微生物、内生菌与连作障碍发生的互作效应已经成为研究热点，连作对土壤细菌变化影响的研究已被陆续报道[9-10]，但研究的重点大多在微生物群落结构变化方面。然而对制种条件下连作对根际与根内生微生物群落结构组成与功能的影响尚不明晰，特别是根际与根内微生物对制种玉米连作效应的响应规律还未见报道。

本研究采用高通量测序技术与大田试验相结合，分析不同连作年限下制种玉米根际与根内细菌群落结构变化特征，结合生物信息学分析，以阐明根际与根内细菌多样性、群落组成和功能随制种玉米连作年限增加的变化特征。揭示连作制种对根际与根内细菌功能的影响规律，以期揭示根际与根内细菌群落结构与功能对连作的响应特征，为有效克服连作障碍、建立科学栽培制度提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试玉米品种为郑单958(母本:郑58，父本:昌7-2)，由中天种业股份有限责任公司提供，平均发芽率99%。

1.2 研究区概况

研究区位于甘肃省张掖市甘州区小满镇大柏村(100°15′E～100°20′E，38°59′N～39°42′N)，该区年均气温7.5℃，年平均蒸发量2000～2100 mm，年平均降水量200～243 mm，全年无霜期130～170 天，土壤类型为灌漠土。

选择种植背景、施肥模式及管理模式均相同，种植年限(1、5、15年)不同的地块为试验田。父母本分期播种，母本于2022年4月10日播种，播后10 天及15 天分别进行一期与二期父本播种，父母本种植模式为行比(1:5)加满天星方式。

1.3 样品采集

大喇叭口期采集根际土壤与植株样品。根际样品按“S”形选择10 株植株，用力摇动根系去除黏附土后，用毛刷采集根际土样混合为1 个土样，放入冰盒后迅速转移到实验室，在超净工作台用无菌镊子剔除植物残体及其他杂质，分为两份，一份储存于-80℃冰箱进行土壤微生物分析，一份经风干研磨过1 mm 及0.25 mm 筛，进行土壤理化性质测定。同时收集不同连作年限地块植株根并装入冰盒，带回室内，植株表面消毒后(75%酒精浸泡30 s，再用0.1%氯化汞溶液浸泡60 s，然后用无菌水冲洗5 遍)，切取若干大小均匀样品，混合均匀，储存于-80℃冰箱，用于高通量测序，每个不同连作年限玉米根际土壤与根组织样品均设6 个生物学重复，微生物测序委托广州美格基因有限责任公司完成。

1.4 土壤分析与测定

土壤理化性质分析参照鲍士旦[11]方法进行：容重的测定采用环刀法；pH 值采用酸度计法(水∶土质量比为5∶1)；土壤有机质采用重铬酸钾容量法测定；土壤全氮采用半微量凯氏法测定；全磷采用氢氧化钠熔溶—钼锑抗比色法测定；全钾采用氢氧化钠熔溶—火焰光度法测定；速效氮采用碱解扩散法测定；速效磷采用碳酸氢钠浸提—钼锑抗比色法测定；速效钾采用醋酸铵浸提—火焰光度法测定。

高通量测序：微生物DNA 采用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit 试剂盒(Omega Bio-Tek,Inc.)提取，细菌以V5 及V7 为引物，对细菌16S rRNA V5-V7 区可变区进行特异性扩增。PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，PCR 仪ABI GeneAmp® 9700 型，扩增体系(20 μL)经组织DNA抽提、PCR 扩增，反应程序：95℃预变性3 min 后，第一轮扩增27 个循环(95℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸45 s)，最后72℃延伸10 min，第二轮扩展13 个循环，其余条件均不变，4℃保温，利用Illumina 公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平台进行测序，测序工作委托广州美格基因公司进行。

1.5 数据处理与分析

采用Excel 2018 和SPSS 23.0 分析处理数据，微生物群落Alpha 多样性差异显著性采用单因素方差分析，LSD(P＜0.05)比较；采用Origin 2021 绘制微生物群落组成堆叠图与功能热图；利用相对丰度＞0.01 的OTUs 数据为样本源，采用Spearman 秩进行共发生网络分析，以相关性(Spearman’sr＞|0.7|)和显著相关性(P＜0.05)为依据探讨共发生模式，于Gephi.0.10 中绘制微生物共现网络图，同时计算相关拓扑学参数；利用R 4.2 以微生物Alpha 多样性与优势菌属为矩阵，采用Mantel test、Pearson 等级相关系数进行相关性分析；利用PICRUSt 软件对OTU丰度表进行标准化后进行功能基因预测分析，将OTU 信息与KEGG 数据库比对，获得各功能基因丰度，参考KEGG 二级代谢通路功能基因类别划分归类，获得通路组成。

2 结果与分析

2.1 制种连作玉米根际细菌多样性分析

不同连作年限的玉米根际细菌的Alpha 多样性测定结果表明，连作年限对根际细菌群落的Richness指数、Chao1 指数及Simpson 指数均有显著影响(P＜0.01)。Richness 指数、Chao1 指数在连作1年与5年之间变化不明显，但连作15年时显著下降；随连作年限增加，Simpson 指数显著下降。结果表明，连作显著降低了根际细菌多样性与丰富度(P＜0.01)(图1 A～C)。

图1 连作年限对制种玉米根际细菌多样性的影响Fig.1 Effect of continuous cropping years on the diversity index of bacteria in maize rhizosphere soil

3 个不同连作年限根际土壤样品细菌OTUs 数在2796～3158 个，且连作1、5 和15年根际土壤OTUs依次显著递减。韦恩图直观反映出不同处理间微生物群落OTUs 组成差异性及重叠关系。本研究采用97% 序列相似度作为OTUs 划分阈值(图1D)。结果显示，3 个不同连作年限共有OTUs 数2143 个，连作1年特有OTUs 1015 个，连作5年特有OTUs 990 个，连作15年特有OTUs 有653 个，不同连作年限根际土壤间OTUs 组成存在较大差异，连作阻碍特有根际细菌物种的生成。根据NMDS 分析结果得知，不同连作年限玉米根际细菌群落间差异显著，连作显著改变了玉米根际细菌的菌群结构(图1E)。

2.2 制种连作玉米根内细菌多样性分析

不同连作年限玉米根内细菌Alpha 多样性分析结果表明，连作年限对根内细菌Richness 指数、Chao1 指数及Simpson 指数均有显著影响(P＜0.01)。随着连作年限增加，根内细菌的Richness 指数、Chao1 指数及Simpson 指数显著下降，连作显著降低了根内细菌群落的多样性与丰富度(P＜0.01)(图2 A～C)。

图2 连作年限对玉米根内细菌多样性的影响Fig.2 Efffect of continuous years on the diversity index of root endophytic bacteria of maize

采用97%的序列相似度作为根内细菌的OTUs划分阈值(图2D)发现，3 个不同连作年限根内细菌OTUs 数在3212～3550 个，且连作1、5 和15年的根内细菌OTUs 依次显著递减。结果显示，3 个不同连作年限根内细菌共有OTUs 2625 个，连作1年特有 OTUs 925 个，连作5年特有 OTUs 885 个，连作15年特有 OTUs 587 个，不同连作年限根内细菌OTUs 组成差异显著，且连作会阻碍特有根内细菌物种的生成。NMDS 分析可知，不同连作年限的玉米根内细菌群落有显著差异，表明连作显著改变了玉米根内细菌的菌群结构(图2E)。

2.3 玉米细菌群落结构对制种连作效应的响应

3 个不同连作年限玉米根际土壤共检出15 个细菌门和19 个细菌属。将平均相对丰度＞0.05 根际细菌门划分为优势细菌门，共有7 个优势细菌门。其中，酸杆菌门(Acidobacteria)在3 个不同连作年限中比例均最高，其他优势菌门分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、芽单胞菌门(Gemmatinonadota)、放线菌门(Actinobacteriota)(图3A)。随着连作年限的增加，酸杆菌门、变形菌门、拟杆菌门、浮霉菌门与芽单胞菌门相对丰度总体下降，而绿弯菌门与放线菌门的相对丰度总体增加。在属水平，将相对丰度＞0.05 的根际细菌属划分为优势细菌属，共10 个优势属。随连作年限的增加，其中Terrimonas、硝化螺旋菌属(Nitrospira)、小梨形菌属(Pirellula)、鞘氨醇单胞属(Sphingomonas)、Chryseolinea、溶杆菌属(Lysobacter)、Haliangium、Bryobacter的相对丰度总体减小，藤黄单胞菌属(Luteimonas)、Pontibacter的相对丰度总体增加(图3B)。说明连作导致制种玉米根际细菌群落的相对丰度发生改变。

图3 连作年限对玉米根际土壤细菌群落结构的影响Fig.3 Effect of continuous cropping years on the bacterial community structure of maize rhizosphere soil

根内细菌群落结构检测结果表明，3 个不同连作年限地块玉米根内组织中总共检出15 个细菌门和20 个细菌属，将相对丰度＞0.05 的根内细菌门划分为优势细菌门，共有4 个优势细菌门。其中，变形菌门在3 个不同连作年限中的比例均最高，其他优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门与放线菌门(图4A)，随连作年限的增加，变形菌门相对丰度增加，而厚壁菌门、拟杆菌门与放线菌门的相对丰度下降。在属水平，将相对丰度＞0.05 的根内细菌属划分为优势细菌属，共10 个。随着连作年限的增加，肠杆菌属(Enterobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、鞘氨醇单胞属(Sphingomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、金黄杆菌属(Chryseobacterium)与葡萄球菌属(Staphylococcus)的相对丰度总体减小，而根瘤菌属(Rhizobium)、泛菌属(Pantoea)与地杆菌属(Pedobacter)的相对丰度先上升后下降(图4B)。说明连作导致制种玉米根内细菌群落的相对丰度发生改变。

图4 连作年限对制种玉米根内细菌群落结构的影响Fig.4 Effect of continuous croppong years on the endophytic bacterial community structure in maize root

2.4 不同连作年限玉米细菌共生网络分析

为进一步了解微生物群落的相似性，利用相对丰度＞0.01 的OTUs 数据构建根际土壤与根内细菌网络(图5)，并计算相关的拓扑性质(表1)。根际细菌群落总连接数以连作1年最高，且随着连作年限的延长逐渐降低。而平均度、密度及平均加权度也表现出一致的变化趋势。同时，连作1、5 和15年处理中，正连接数的数量多于负连接数的数量，且随连作年限的延长，正连接数的比例逐渐降低。这些结果表明，3 个连作处理中，连作1年的细菌网络复杂性最高，而连作15年的复杂性最低。此外，连作1年根际菌群模块化程度最高，且模块化指数随连作年限增加而下降。同时，根内细菌网络的复杂性与模块化程度的变化与根际细菌变化一致，连作降低了制种玉米根际与根内细菌网络的复杂性与模块化程度。

表1 不同连作年限制种玉米细菌群落共生网络主要拓扑性质Table 1 Major topological properties of bacteria under different continuous cropping years of maize

图5 不同连作年限下制种玉米细菌共现性网络Fig.5 Co-occurrence network of bacteria in fields under different continuous cropping years of maize

2.5 制种连作玉米根际土壤理化性质分析

随连作年限变化，土壤理化性质间表现出明显差异，随连作年限增加，土壤理化性质发生改变。与连作1年比，连作5年与连作15年的土壤容重、全磷、全氮、速效磷、速效氮及pH 显著增加，总孔隙度、速效钾及有机质含量显著下降(P＜0.05)，连作导致制种玉米田全磷、全氮养分量增加，而钾素的有效性下降(表2)。

表2 制种玉米不同连作年限土壤理化性质Table 2 Physicochemical properties of soils under different continuous cropping years of maize

2.6 环境因子与微生物群落结构及多样性之间的相关性

为了探寻制种玉米土壤理化性质与玉米根际、根内细菌的α-多样性及优势菌属的关系，本研究采用Mantel test 进行表征，结果如图6所示。根内细菌与根际细菌的α-多样性、根际细菌的优势菌属与土壤pH、有机质、全氮、全磷、全钾、速效磷、速效氮、速效钾间极显著相关(P＜0.01，r≥0.4)。根内细菌的优势菌属与土壤有机质、全氮、全钾、速效氮、速效钾呈显著相关性(P＜0.05)，根际与根内效应不同步，根际效应大于根内效应。同时，土壤pH、有机质、全氮、全磷、全钾、速效磷、速效氮、速效钾之间呈极显著相关(P＜0.01)。

图6 环境因子与微生物群落结构及多样性之间的相关性Fig.6 Correlations between environmental factors and microbial community structure

2.7 细菌 PICRUSt 功能预测分析

通过KEGG 数据库进行对比，分析丰度位于前15 名的根际土壤与根内组织细菌群落的基因功能。随着连作年限增加，根际抗生素类生物合成及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成、脂肪酸合成、C5二元酸代、硫辛酸代谢、泛酸盐和辅酶A 生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、氨酰生物合成 、肽聚糖生物合成、D-丙氨酸代谢、脂多糖生物合成、细胞循环以及硫传递系统的相对丰度均降低(图7A)。

图7 KEGG 二级代谢通路相对丰度Fig.7 The relative abundance of KEGG pathway(levelⅡ)

根内丰度前15 位的细菌群落的基因功能，亮氨酸和异亮氨酸生物合成、泛酸生物合成、万古霉素生物合成、泛酸盐和辅酶A 生物合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、肽聚糖生物合成、链霉素生物合成、One carbon pool by folate、D-丙氨酸代谢、硫辛酸代谢、丙氨酸盐与谷氨酸代谢相对丰度总体降低；安沙霉素的生物合成、酮体合成与降解 、细菌趋化性和C5 二元酸代谢的相对丰度总体增加(图7B)。

连作对制种玉米根际与根内细菌群落的功能有显著影响，但玉米根际与根内细菌群落功能组成间存在显著差异，根际细菌功能对连作的响应特征大于根内细菌。

3 讨论

3.1 制种连作降低了玉米根际、根内细菌多样性与网络复杂性

微生物群落的多样性和丰富度被认为是土壤生态系统完整性、功能和可持续性的关键[12]。本研究中，多年连作制种玉米根际细菌多样性与丰富度降低，这与前人[5]研究结果一致。连作后植物、微生物、土壤环境及其相互作用的改变存在动态关联。根系分泌物对特定真菌群落的选择能力增强，微生物群落结构的改变同样导致根际微生态系统养分转化的改变[13-15]。高肥力土壤可以促进细菌的生长与繁殖，有利于根际土壤中细菌丰富度的提高，而过量施用化学肥料、农药以及土壤自毒物质累积与养分失衡，导致微生物多样性下降[16-17]。本研究发现，随连作年限的增加，根内细菌的多样性与丰富度显著降低。内生菌的定殖受植物根际分泌物与土壤环境的影响[8,18]，根际分泌物可以调控植物内生菌群的装配过程[19]。连作降低内生菌多样性，阻碍了内生菌的定殖。本研究发现，随制种玉米连作年限的延长，根际与根内细菌网络的复杂性和菌群模块化程度逐渐降低。前人研究表明，具有复杂网络结构的细菌群落具有更强的抵抗外界环境干扰的能力[20]。因此，连作年限的增加导致制种玉米根际与根内细菌对外界环境变化的抵抗力减弱[21]，不利于土壤健康与植物体内微生物平衡的可持续发展。此外，制种玉米连作细菌网络复杂性和菌群模块化程度与土壤养分变化趋势同步，土壤功能受细菌网络的复杂性和菌群模块化程度差异影响较大。

3.2 制种连作差异性改变了玉米根际、根内细菌群落组成

前人研究表明，根际微生物群落在维持土壤生态平衡与健康过程中起着重要作用[12]。本研究中，随连作年限增加，制种玉米根际与根内细菌群落发生差异变化。根际寡营养型菌门酸杆菌门[22]相对丰度总体下降，富营养型菌门放线菌门[23]相对丰度总体增加，其他富营养型菌门如变形菌门与拟杆菌门[23]的相对丰度在连作后明显降低，且其相对丰度随土壤养分的变化保持一致；而根内寡营养型菌门中具有极强抗逆性的厚壁菌门相对丰度下降。变形菌门与放线菌门相对丰度变化特征与根际相反，拟杆菌门变化与根际一致。此外，随着连作年限的增加，根际具有显著生防与促生功能的有益细菌鞘氨醇单胞属、溶杆菌属及硝化螺旋菌属[24]相对丰度总体减小，此外参与有机质降解过程的Haliangium与Bryobacter[25]相对丰度也降低。连作导致玉米根际有益微生物减少[3]。随着连作年限增加，根内有益菌假单胞菌属、鞘氨醇单胞属、根瘤菌属、泛菌属相对丰度总体减小，制种玉米连作阻碍根内有益菌的定殖。表明连作对根内细菌群落的影响与根际细菌不同步发生，根内与根际微生物群落发生生态位分异。根际微生物对根际环境特征动态响应，而根内微生物策略性响应根际微生物动态。变形菌门、酸杆菌门主要参与土壤碳循环和氮循环，而芽单胞菌门、浮霉菌门与土壤氮素代谢密切相关[26-27]，上述微生物相对丰度的降低不利于土壤有机质的降解和生物地球化学循环。放线菌门可以促进土壤有机质的分解及解磷的能力，喜欢在有机质低的环境生长与繁殖[26,28]，有机肥施用有利于拟杆菌门的富集[29]，这与本研究中微生物在门水平的变化趋势一致。而厚壁菌门相对丰度的下降在一定程度上增加了植株感病的风险[23]。玉米根部相关细菌的定殖与多种因素(湿度、温度、pH、盐分、氧气含量等)有关，同时具有选择性，从根际到根系逐步专一化，且根内微生物的生长压力随生育期增大[30]，根际微生物群落的丰富度与均匀度远远大于根内，连作导致土壤自毒物质累积及养分失衡，在一定程度上改变了根际菌群的生长策略，根际细菌群落发生规律性演替，而根内微生物多来自根际，内生菌定殖也动态变化，并表现出一定的响应特征与策略性变化，根际土壤-根系界面的微生物群落生态位分化明显不同，茎和叶内微生物组表现出额外的微调性与适应性[31]。此外，根内细菌的代谢途径也显著改变，富营养型菌放线菌门与拟杆菌门相对丰度随连作年限增加而下降，内生菌会增强植物的抗性，更好的从逆境中恢复[32]。内生菌与宿主植物协同进化，其定殖受根系分泌物及土壤理化性质的影响[8-9]，具备了成功侵入和定殖于宿主植物体内的能力[33]。

3.3 制种连作非同步降低玉米根际、根内细菌功能

本研究中随连作年限增加，根际细菌代谢与细胞过程相对丰度均显著降低，根内细菌部分代谢过程的相对丰度降低的结果与前人[23]研究结果一致。代谢功能的变化可能与连作导致根际、根内优势细菌群落变化及群落多样性降低相关。代谢作为土壤微生物群落的核心功能，在土壤细菌生长过程中有着极其重要的作用[34]。有研究发现，土壤细菌通过代谢活动来参与土壤物质循环与转化，如固氮、解钾及解磷等作用，并通过代谢提高根系对养分元素氮、磷、钾的吸收；土壤作为微生物生存繁殖的大本营，土壤环境因子的变化在一定程度上改变了土壤微生物群落结构[35]。Mantel test 分析结果表明，土壤pH、有机质、全氮、全磷、全钾、速效磷、速效氮和速效钾是影响根际细菌群落的主要环境因子，且土壤有机质、全氮、全钾、速效氮和速效钾是影响根内细菌群落的主要环境因子。根际土壤中逐渐富集细菌的一般组成和功能，不同根际土壤中富集与物质降解、养分代谢和抗生素生物合成相关的微生物[36]。细菌能够通过合成次级代谢物(抗生素类物质)来抑制土壤中病原性疾病的传播，从而保持宿主健康[5,37]，植物不同器官间微生物数量巨大的差异，归因于根际土壤中的稀有OTU，它们通过对环境变化做出快速的反应来促进群落的稳定性[31]。由于土壤理化性质影响植物根系生理活动和根系分泌物组分，进而影响根际微生物变化与内生菌定殖[38]。微生物间相互作用网络性质及模块化程度与土壤系统的功能密切相关，土壤微生物组网络复杂性对多功能性的影响大于微生物组多样性和群落组成，网络复杂性在维持土壤功能中起到关键作用[39]，而内生菌能诱导植物产生诱导系统抗性与系统获得性抗性[40]，进而诱导植物对病菌的抗性，因此合理施肥，科学调节农田土壤养分平衡，从而增强微生物群落的稳定性是缓解作物连作障碍的有效手段[41]。

4 结论

制种连作导致土壤理化性质发生改变，根际、根内有益细菌丰度降低，根际、根内细菌功能总体降低。进一步影响根际与根内细菌的群落组成与功能，连作障碍发生，而根内微生物动态响应，策略性的调整微生物群落结构。根际与根内微生物群落对连作效应的响应动态不同步发生，根际与根内群落发生生态位的分异，根际效应大于根内效应。可以利用根际与根内微生物生态位差异及不同步效应，更深入地了解细菌群落对宿主植物应对外界变化的反应性，在根际环境中富集细菌的组装和有益菌在根内环境中的适应角色提供新见解。