不同生物刺激素对玉米生长及土壤微生物群落结构的影响

李炳言，宋大利，王秀斌，赵士诚，周 卫

（中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 / 北方干旱半干旱耕地高效利用全国重点实验室 /农业农村部植物营养与肥料重点实验室，北京 100081）

生物刺激素被定义为“一种物质或微生物，当应用于种子、作物或土壤时，能够刺激自然过程，促进作物养分吸收，提高养分利用率，增强作物对环境胁迫的耐受性，增加作物产量和改善籽粒品质”。农业中常见的生物刺激素包括海藻糖、壳聚糖、腐植酸和γ-氨基丁酸等，当土施或喷施时可以直接被土壤微生物和植物吸收利用，并且不会对环境造成负面影响[1-4]。因此，生物刺激素的应用被认为是实现农业绿色可持续发展的重要措施。

海藻糖是一种非还原性二糖，广泛存在于各种生物体中，具有运输糖的功能，以及参与植物或微生物的应激保护，维持其正常的生命过程和生物特征[5]。壳聚糖是仅次于纤维素的地球上第二大丰富的天然生物聚合物，其作为一种抗菌剂和生长调节剂，具有抑制病原体生长、提高作物抗逆性、促进养分吸收和作物生长的功能[6-7]。腐植酸是腐殖质的主要成分，具有改善土壤质地，增强微生物代谢活动，增加养分有效性和促进作物生长的功能[8-9]。γ-氨基丁酸是一种四碳非蛋白质氨基酸，天然存在于所有生物体中，具有提高作物碳氮代谢，提高其抗氧化能力，并促进其生长的功能，同时参与微生物与植物间的物质和信息交换[10]。

Ali 等[11]通过盆栽试验研究发现，海藻糖喷施显著提高了玉米生物量和叶片光合能力，同时增强了玉米对干旱胁迫的抵抗力。施用壳聚糖通过提高抗氧化酶活性和渗透调节物质含量，降低丙二醛的过度积累，从而减轻非生物胁迫造成的氧化损伤[12]。Altaii[13]研究发现，施用腐植酸有助于提高沙土和沙壤土中微生物活性和有机质含量，并促进土壤中钙、镁和钾等养分的释放。当应用于玉米时，腐植酸有助于提高玉米ATP 合成酶活性，以及提高生长素、可溶性糖、脯氨酸和甜菜碱的含量[14]。Yu 等[15]认为，γ-氨基丁酸通过促进作物体内氨基酸和活性肽的积累，提高类黄酮和有机酸的含量，从而改善作物的营养品质。此外，γ-氨基丁酸能够降低丙二醛和活性氧的含量，促进脯氨酸的合成，增强作物对干旱、盐害和高温等非生物胁迫的抵抗力[16]。关于生物刺激素对作物生长的影响已进行了大量研究。然而，针对不同生物刺激素对土壤酶活性及微生物群落结构的影响却鲜有报道。基于此，本研究以海藻糖、壳聚糖、腐植酸和γ-氨基丁酸为对象，通过分析玉米干物质量、产量形成以及土壤酶活性、微生物生物量和微生物群落结构变化，从土壤酶和微生物的角度阐明不同生物刺激素对玉米生长的影响，并揭示其调控机制，旨为利用生物刺激素提高作物产量和养分利用效率提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

田间试验位于河南省新乡市原阳县河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地(东经113°40′42′′，北纬34°47′55′′)，该地区属暖温带季风气候区，年平均温度14.4℃，年降雨量645 mm。供试土壤类型为石灰性潮土，0—20 cm 土层土壤基本理化性质如下：pH 7.68，有机质含量13.75 g/kg，铵态氮含量1.52 mg/kg，硝态氮含量13.4 mg/kg，电导率(EC)值162.6 μS/cm，速效钾含量121.08 mg/kg，速效磷含量30.4 mg/kg，全氮含量1.13 g/kg。

1.2 试验材料

供试玉米品种为‘浚单20’。海藻糖购于日本株式会社林原，纯度为99.4%；壳聚糖购于南通兴成生物制品厂有限公司，纯度为91.1%；腐植酸购于河南心连心化学工业集团股份有限公司，以干基计其含量大于60.0%；γ-氨基丁酸购于山东杰诺生物酶有限公司，纯度为98.9%。

1.3 试验设计

田间试验共设置5 个处理：1)对照(CK)，不施生物刺激素；2)施海藻糖30 kg/hm2；3)施壳聚糖30 kg/hm2；4)施腐植酸30 kg/hm2；5)施γ-氨基丁酸30 kg/hm2。试验小区面积为48 m2(6 m×8 m)，每个处理3 次重复。为保证施用均匀一致，将生物刺激素与3 kg 土壤混匀，在玉米种植前开沟施入土壤。各处理氮、磷和钾用量均分别为N 210 kg/hm2、P2O575 kg/hm2和K2O 90 kg/hm2，所有肥料均一次性施入。玉米播种时间为2021年6月8日，播种深度为7 cm，每个小区播种10 行。收获时间为2021年10月4日。田间管理措施按照当地农业生产实践进行。

1.4 样品采集与测定

在玉米6 叶期(V6)采集土壤样品，土样采集前清除土壤表面的枯落物。每个小区随机采集5 个点(20 cm)作为混合样本，样品采集后放入带有冰袋的保温箱中运回实验室进行后续处理。样品到达实验室后过2 mm 筛，并去除非土壤物质，混匀后分为2份，分别保存于 4℃和-80℃，用于土壤酶活性和磷脂脂肪酸分析。此外，在采集土壤样本时，每个小区采集9 株以上具有完整功能的玉米植株样品带回实验室。植株样本用去离子水清洗根系和叶面附着的杂质，然后于72℃烘干至恒重，用于计算干物质量[17]。此外，在成熟期收获每小区的玉米，用于测定产量、千粒重、穗粒重和单穗重，玉米籽粒产量按照14%含水量进行计算[18]。

土壤脲酶、脱氢酶和碱性磷酸酶活性的测定按照试剂盒说明书(苏州格锐思生物科技有限公司)进行。土壤脲酶测定步骤：新鲜土样风干后，过0.425和0.250 mm 筛，称取0.1 g 土样加入甲苯试剂，室温震荡15 min，依次加入反应液，混合均匀，室温12000 r/min 离心10 min，取上清液测定。土壤脱氢酶测定：鲜土过0.425 mm 筛后，称取0.1 g 土样加入反应液，剧烈混匀，37℃避光培养4 h，12000 r/min离心5 min，取上清液测定，原理是利用改性的氮四唑盐作为氢受体，生成的有色甲臜物质易溶于水，在460 nm 处具有最大吸收峰，颜色越深，酶活性越大。土壤碱性磷酸酶测定：风干土样过0.425 mm 筛后，称取0.1 g 加入甲苯和反应液，12000 r/min 室温离心10 min，上清液转移到玻璃比色皿中用于测定，因碱性磷酸酶催化磷酸对硝基苯酯生成黄色对硝基苯酯，该产物在405 nm 处具有最大吸收峰，通过检测黄色对硝基苯酯的增加速率计算碱性磷酸酶活性。

磷脂脂肪酸分析：称取3.0 g 冷冻干燥后的土壤样本，加入20 mL 单相提取试剂[v(氯仿)∶v(甲醇)∶v(柠檬酸)=1∶2∶0.8]，室温混匀2 h，置于5000 r/min 下离心5 min，取上清液加入柠檬酸和氯仿，静置后吸取下层氯仿到新的玻璃试管中，采用氮吹仪浓缩干燥混合液，收集到的样品经磷脂分离和甲酯化后进行磷脂脂肪酸分析，测试均采用标准品进行校正。特定微生物群落的鉴定按照Dai 等[19]发表的分类方法进行。

1.5 数据分析

数据采用IBM SPSS Statistics 23 软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，结果展示为平均值±标准误差(SE)，显著性水平为0.05，图形绘制采用Prism 9 和Excel 2021。

2 结果与分析

2.1 生物刺激素对玉米干物质积累的影响

由图1 可知，生物刺激素显著增加了玉米干物质量。其中，腐植酸和γ-氨基丁酸处理中地下部的干物质量显著高于对照(P＜0.05)，增幅分别为43.1%和35.1%。此外，各生物刺激素处理的地上部和整株植物的干物质量均显著高于对照(P＜0.05)，其中以腐植酸处理效果最显著(P＜0.05)，分别提高114%(地上部)和101%(整株)。进一步比较玉米根冠比发现，腐植酸处理显著降低了根冠比(P＜0.05)，较对照降低32%，而其他生物刺激素处理与对照相比无显著差异(P＞0.05)。

图1 生物刺激素对玉米各部位干物质积累的影响Fig.1 Effects of biostimulants on dry matter accumulation in different parts of maize

2.2 生物刺激素对玉米产量形成的影响

由表1 看出，生物刺激素对穗粒数均无显著影响；海藻糖、壳聚糖和腐植酸显著提高了千粒重，较对照分别增加了5.5%、4.9%和8.2%；腐植酸和海藻糖处理的单穗重显著高于对照，增幅分别为13.6%、12.5%(P＜0.05)；腐植酸处理的产量显著高于对照(P＜0.05)，增产率为10.2%，其他生物刺激素的增产效果未达显著水平。

表1 生物刺激素对产量及其构成的影响Table 1 Effects of biostimulants on yield and its components

2.3 生物刺激素对土壤酶活性的影响

由图2 看出，海藻糖、壳聚糖、腐植酸和γ-氨基丁酸对脲酶活性无显著影响，但均显著提高了土壤碱性磷酸酶活性，同时海藻糖、壳聚糖和腐植酸还显著提高了脱氢酶活性(P＜0.05)，但各生物刺激素之间对土壤酶活性的影响无显著差异。

图2 生物刺激素对土壤酶活性的影响Fig.2 Effects of biostimulants on soil enzyme activity

2.4 生物刺激素对土壤微生物量的影响

由图3 可知，生物刺激素提高了土壤微生物生物量，其中以腐植酸处理增幅最大。具体而言，腐植酸和海藻糖处理的土壤微生物总生物量较对照分别显著增加了29.3%和22.7%。此外，腐植酸处理同样显著提高了细菌生物量(P＜0.05)，与对照相比增幅为43.9%。而与对照相比，各生物刺激素处理未显著改变真菌生物量(P＞0.05)，腐植酸和海藻糖处理显著提高革兰氏阳性菌生物量(P＜0.05)，增幅分别为48.8%和39.4%，腐植酸处理显著提高革兰氏阴性菌生物量(P＜0.05)，增幅为40.5%。然而，各生物刺激素处理较对照均未显著改变革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的比值(P＞0.05)，但是不同生物刺激素处理间表现出显著差异(P＜0.05)，例如腐植酸处理革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的比值高于γ-氨基丁酸处理，增幅为6.8%。

图3 生物刺激素对土壤微生物生物量的影响Fig.3 Effects of biostimulants on soil microbial biomass

2.5 生物刺激素对土壤微生物群落相对丰度的影响

由图4 看出，生物刺激素未显著改变土壤微生物群落相对丰度(P＞0.05)。总体而言，土壤微生物群落以细菌为主(48.41%)，革兰氏阳性菌为20.20%，革兰氏阴性菌为26.71%，真菌和放线菌分别为9.69%和11.20%。各生物刺激素处理的革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、细菌、真菌和放线菌的相对丰度较对照均无显著差异(P＞0.05)。

图4 生物刺激素对微生物群落相对丰度的影响Fig.4 Effects of biostimulants on the relative abundance of microbial communities

2.6 玉米干物质量、产量、土壤酶活性与微生物生物量的相关性分析

由玉米生长参数与土壤酶活性、微生物生物量各指标间的相关关系(图5)可以看出，产量与微生物生物量、细菌生物量、革兰氏阳性菌生物量，以及地下部、地上部和整株干物质量均呈显著正相关关系(P＜0.05)，而与土壤酶活性关系不显著(P＞0.05)。土壤脱氢酶与土壤碱性磷酸酶显著正相关(P＜0.05)，土壤脲酶与微生物生物量、细菌生物量、真菌生物量、革兰氏阳性菌生物量和革兰氏阴性菌生物量显著正相关(P＜0.05)，土壤碱性磷酸酶与微生物生物量、细菌生物量和革兰氏阳性菌生物量显著正相关(P＜0.05)。此外，土壤微生物生物量、细菌生物量、革兰氏阳性菌生物量、革兰氏阴性菌生物量与玉米地上部和整株的干物质量呈显著正相关关系(P＜0.05)。

图5 玉米干物质量、产量、土壤酶活性与微生物生物量之间的皮尔逊相关性分析Fig.5 Pearson correlation analysis between maize dry matter mass,yield,soil enzyme activity and microbial biomass

3 讨论

生物刺激素的施用有助于促进作物生长，增强养分吸收，提高养分利用率，被认为是实现化肥减施增效的重要手段[20-21]。过去的10年中，有超过700篇以上的科学论文报道了微生物和非微生物生物刺激素引发的植物形态、生理生化和分子反应等一系列的变化，证实生物刺激素具有调节作物生长的作用，且不同类型生物刺激素的施用效果存在较大差异[22]。本研究发现，腐植酸的施用显著提高了玉米千粒重、单穗重和产量，增产率为10.2%，而海藻糖、壳聚糖和γ-氨基丁酸对产量无显著影响(P＞0.05)。Song 等[23]研究表明，施用腐植酸通过提高氮肥利用率，促进玉米对氮素的吸收，增加玉米产量。另外，腐植酸显著提高了玉米地下部、地上部和整株植物干物质量，增幅分别达到43.1%、114%和101%，是供试生物刺激素中增效最大的物质。Nikbakht等[24]发现，施用腐植酸通过提高作物体内的氮、磷和钾等养分的含量，促进了干物质的积累。成熟期玉米累生物量与产量呈高度线性相关，且无论在什么情况下，田间玉米的生物量均与产量密切相关[25]。相关性分析显示，玉米地下部、地上部和整株干物质量与产量之间显著正相关(P＜0.05)，并且与地下部干物质量相比，地上部和整株的干物质量对产量形成的贡献可能更大，这是因为土壤细菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生物量与二者均存在正相关关系(P＜0.05)，表明土壤微生物群落活动在调节作物产量形成的过程中，地上部可能占据更重要的地位。

土壤中的磷浓度通常比植物中高2000 倍，但常以铝/铁或钙/镁磷酸盐的形式存在[26]。微生物通过合成碱性磷酸酶，催化有机磷水解，提高磷生物可用性[27]。本研究中，4 种生物刺激素(海藻糖、壳聚糖、腐植酸和γ-氨基丁酸)均显著提高了土壤碱性磷酸酶活性(P＜0.05)。Jat 等[28]通过2年的田间试验表明，施用生物刺激素通过提高土壤碱性磷酸酶活性，增加土壤有效磷含量，促进作物地下部和地上部干物质的积累。Tejada 等[29]研究发现，施用生物刺激素显著提高了土壤磷酸酶活性，且增加了革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌生物量。碱性磷酸酶主要由微生物产生，并且后者被认为是微生物磷周转的主要驱动因素。因此，生物刺激素促进玉米生长可能是通过增强微生物的代谢活动，提高土壤磷酸酶活性，促进磷的再动员，增强作物对养分的吸收来实现的。土壤脱氢酶活性能够反映土壤中活性微生物生物量及有机物的降解潜力[30]。海藻糖、壳聚糖和腐植酸处理均显著提高了土壤脱氢酶活性(P＜0.05)。Tejada 等[31]研究表明，生物刺激素可提高土壤脱氢酶活性，促进土壤有机质的分解和矿化，以提高有机碳的可用性。与土壤碱性磷酸酶和脱氢酶不同，土壤脲酶活性在生物刺激素处理中未发生显著变化(P＞0.05)，这与Zielewicz 等[32]的研究结果相似。

土壤微生物作为生态系统的分解者，影响着生物地球化学循环[33-34]，而施用生物刺激素可能会引起土壤微生物中特定种群的变化[35]。本研究发现，腐植酸处理显著提高了土壤微生物、细菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生物量(P＜0.05)。Rodríguez-Morgado等[36]发现，施用生物刺激素显著增加了细菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生物量。此外，施用海藻糖、壳聚糖、腐植酸和γ-氨基丁酸对土壤微生物群落相对丰度均无显著影响(P＞0.05)，细菌仍是土壤微生物群落的最大组分(占比48.41%)。Fu 等[37]采用16S rRNA高通量测序技术研究了腐植酸对土壤微生物群落结构的影响，结果表明施用腐植酸改变了微生物群落结构，具有抗性的双胞菌门、厚壁菌门和酸杆菌门的丰度显著提高(P＜0.05)，但主要细菌群落的丰度较对照无显著差异(P＞0.05)，与本研究结果一致。与高通量测序技术相比，本研究中采用的磷脂脂肪酸分析仅能获得生物刺激素对主要微生物群落结构的影响，而对土壤微生物中特定群落活动的影响尚不清楚，因此，后续需要开展更为深入的研究工作。相关性分析表明，土壤微生物、细菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生物量，以及土壤脱氢酶和土壤碱性磷酸酶活性与玉米干物质量呈显著正相关关系(P＜0.05)，同时，产量与微生物生物量和玉米干物质量均呈显著正相关关系(P＜0.05)，这表明生物刺激素可通过提高土壤微生物生物量和土壤酶活性，促进玉米生长和增产。

4 结论

海藻糖、壳聚糖、腐植酸和γ-氨基丁酸的施用均有助于改善玉米生长状态。其中，施用腐植酸可增强土壤碱性磷酸酶和脱氢酶活性，提高土壤微生物、细菌、革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌生物量，促进地下部和地上部干物质积累，进而增加玉米千粒重、单穗重和产量，且较其他生物刺激素处理效果显著，在农业生产中具有较好的应用前景。