基于网络药理学和动物实验探讨白藜芦醇抗脊髓损伤作用机制

王国栋 聂兴国 寇海龙 李 琦

新乡医学院第一附属医院 1 急救医学科 2 骨外科三病区,河南省新乡市 453000

脊髓损伤是一种严重的创伤性疾病,会导致脊髓受损部分以下的身体运动和感觉缺陷,伴随着生理、生化和结构异常。脊髓损伤严重危害生理系统,如心血管和免疫系统[1]。病人的生活质量往往会受到严重影响。脊髓损伤的全球总发病率约为750/100万人[2]。在目前的治疗方法中,甲基强的松龙是成年期脊髓损伤患者的常用治疗方法,而这种治疗方法因其疗效和副作用有限而备受争议[3-4]。因此,迫切需要开发有效的脊髓损伤治疗方法并探索其潜在机制。

白藜芦醇是一种广泛用于治疗脑卒中的辅助药物。白藜芦醇对神经具有保护作用,不仅可以改善脑缺血再灌注的预后,还可以影响脑损伤后的学习和记忆功能[5]。研究发现,白藜芦醇对脊髓缺血损伤具有保护作用[6],可促进脊髓损伤后功能恢复和轴突再生,改善组织学损伤[7],可有效预防脊髓损伤的继发性损伤[8]。然而,其作用机制及治疗靶点尚不清楚。网络药理学是一个基于系统药理学研究药物与疾病之间相互作用的发展领域[9]。它可以提供治疗该疾病的药物机制的全貌。在网络药理学中,药物靶向网络对理解药物的作用机制起着非常重要的作用。本研究采用网络药理学的方法,对白藜芦醇抗脊髓损伤的主要机制进行研究。

1 资料与方法

1.1 白藜芦醇抗脊髓损伤作用靶点的获得 使用中药系统药理学分析平台(TCMSP)搜集及Swiss(http://www.swisstargetprediction.ch/)平台预测,获得白藜芦醇作用靶点。使用Gene card(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drug bank(https://www.drugbank.com/)数据库搜集脊髓损伤相关靶点,并将所得靶点合并。使用韦恩图(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)对二者取交集,所得的交集靶点即为白藜芦醇抗脊髓损伤的作用靶点。

1.2 白藜芦醇抗脊髓损伤靶点蛋白的互作网络图(PPI)的构建 将白藜芦醇抗脊髓损伤的作用靶点输入STRING网站(https://cn.string-db.org/),获得蛋白质相互作用的文件。将此文件导入cytoscape,即可得白藜芦醇抗脊髓损伤靶点蛋白的互作网络图(PPI)。根据网络图中,各靶点蛋白的点度中心性(degree)等参数的大小筛选关键作用靶点,其值越大说明在网络中越重要[10]。

1.3 白藜芦醇抗脊髓损伤靶点的GO与KEGG通路分析 将白藜芦醇抗脊髓损伤的作用靶点导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/),网站对其进行GO富集分析与KEGG通路分析。GO富集分析包括分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞组成(CC)三个部分。

1.4 验证实验

1.4.1 动物。雌性SD大鼠36只(8～12周龄),SPF级,体重180～200g,购自河南省实验动物中心[许可证号为SCXK(豫) 2017-0001]。适应性喂养1周,温度保持在(25±1)℃,每12h改变1次光/暗周期。大鼠随机分为三组:假手术组、溶媒组和白藜芦醇组。

1.4.2 脊髓损伤大鼠模型的建立。利用改进的Allen技术建立脊髓损伤模型。大鼠使用10%水合氯醛(0.33ml/100g)麻醉,以俯卧姿势固定。以T10棘突为手术区域中心,背部中间切口为3～4cm,T9～10棘突后脊髓明显暴露,椎板被切除。脊髓损伤通过快速下落的钝头冲击针(重10g,直径2mm)从30mm的高度迅速诱发。成功冲击的迹象包括脊髓组织水肿、出血、延迟性瘫痪和粪便失禁。假手术组麻醉后仅行椎板切除术,无脊髓挫伤。在脊髓损伤后2h,通过腹腔注射将白藜芦醇(50mg/kg)和等量蒸馏水分别给予白藜芦醇组和溶媒组的大鼠,此后1次/d,持续给药2周。每天进行2次膀胱按摩,以帮助脊髓损伤后的大鼠排出尿液。

1.4.3 功能分析。在术前和脊髓损伤后1、3、7、14、21、28和35d根据Basso、Beattie和Bresnahan(BBB)运动评定量表评估脊髓损伤后运动功能的恢复[11]。BBB评分范围为0～21分。最低分为0分=完全瘫痪,最高分为21分=正常。平均得分用于反映各组运动功能恢复的进展。

1.4.4 白藜芦醇对脊髓损伤大鼠AKT1、TNF、VEGFA mRNA表达的影响。使用Trizol试剂盒从组织中提取总RNA。使用Oligo(dT)12～18引物和Superscript Ⅱ逆转录酶从2μg总RNA合成cDNA。SYBR Green荧光染料检测AKT1、TNF、VEGFA和GAPDH mRNA表达。引物序列如下:AKT1,上游 5’-ACCTCTGAGACCGACACCAG-3’,下游 5’-AGGAGAACTGGGGAAAGTGC-3’;TNF,上游 5’-TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC-3’,下游 5’-CAGCCT TGTCCCTTGAAGAGAACC-3’;VEGFA,上游 5’-CCACGACAGAAGGGGAGCA-3’,下游 5’-GTGCTGGCTTTGGTGAGG-3’;GAPDH,上游5’-TATGACAACTCCCTCAAGAT-3’,下游5’-AGATCCACAACGGATACATT-3’。两步法扩增条件为:95℃先预变性30s;随后 95℃ 5s,60℃ 20s,共进行35个循环。以GAPDH作为内源性参照,应用2-ΔΔCt法对数据进行相对定量分析。

1.4.5 免疫组化检测脊髓组织中AKT1表达。大鼠麻醉、固定后,取出T9～10脊髓组织,石蜡包埋。切片脱蜡至水后,滴加3%过氧化氢,灭活内源酶活性。5%山羊血清封闭1h后,滴加兔抗AKT1,4℃ 过夜。PBS冲洗后,滴加辣根过氧化物酶标记的二抗,37℃孵育20min。观察二氨基联苯胺显色约5min,使用PBS及时停止反应。切片用苏木精复染。阴性对照用PBS代替一抗。奥林巴斯光学显微镜下观察并拍照。

1.5 统计学方法 使用GraphPad Prism 7.0对数据进行分析,并以均值±标准差表示。使用单因素方差分析评估多组之间的差异。使用Mann-WhitneyU检验评估BBB评分。P<0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 白藜芦醇抗脊髓损伤作用靶点的获得 由图1可见,白藜芦醇作用靶点148个,脊髓损伤相关靶点1 027个,二者取交集,共获得白藜芦醇和脊髓损伤交集靶点即白藜芦醇抗脊髓损伤作用靶点48个。

图1 白藜芦醇与脊髓损伤相关靶点交集的韦恩图

2.2 白藜芦醇抗脊髓损伤作用靶点的PPI网络图 白藜芦醇抗脊髓损伤作用靶点蛋白相互作用的网络图,见图2。根据网络图中度中心性的大小,共筛选出关键作用靶点8个,即AKT1、TNF、IL-1B、VEGFA、IL-6、JUN、CASP3、HIF1A。排名前三的为AKT1、TNF、VEGFA。

图2 白藜芦醇抗脊髓损伤靶点蛋白的PPI图

2.3 白藜芦醇抗脊髓损伤靶点的GO富集分析结果 由图3 GO富集分析结果可知,生物过程(BP)主要涉及活性氧代谢过程、细胞对化学应激的反应、对脂多糖的反应等;细胞组成(CC)主要涉及薄膜筏、膜微区、膜区等;分子功能(MF)主要涉及细胞因子受体结合、细胞因子活性、受体配体活性等。

图3 白藜芦醇抗脊髓损伤靶点的GO富集分析图

2.4 白藜芦醇抗脊髓损伤靶点的KEGG通路分析结果 由图4 KEGG通路分析结果可知,富集显著的通路主要有:TNF 信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号通路等。

图4 白藜芦醇抗脊髓损伤靶点的KEGG通路图

2.5 白藜芦醇对脊髓损伤后大鼠运动功能改善作用 由图5可知,溶媒组和白藜芦醇组的BBB评分在受伤后第1天为0分。从第1～7天,溶媒组和白藜芦醇组之间的BBB评分无显著差异(P>0.05)。然而,在脊髓损伤后14、21、28和35d,白藜芦醇组大鼠的BBB评分显著高于溶媒组大鼠(P<0.05)。这些结果表明,脊髓损伤后白藜芦醇的干预显著改善了运动功能。

图5 白藜芦醇对脊髓损伤后大鼠运动功能改善作用

2.6 白藜芦醇对脊髓损伤大鼠 AKT1、TNF、VEGFA mRNA表达的影响 与假手术组相比,溶媒组TNF mRNA表达明显升高(P< 0.01),AKT1、VEGFA mRNA表达也有所升高。与溶媒组相比,白藜芦醇组TNF mRNA表达明显降低(P< 0.01),AKT1、VEGFA mRNA表达明显升高(P<0.01),见图6。

图6 白藜芦醇对脊髓损伤大鼠 AKT1、TNF、VEGFA mRNA表达的影响

2.7 免疫组织化学分析结果 AKT阳性细胞棕黄色,假手术组阳性细胞较少见。与假手术组相比,溶媒组AKT1阳性表达增加,而白藜芦醇组AKT1表达明显强于溶媒组,见图7。

a b

3 讨论

脊髓损伤(SCI)是由创伤引起的脊髓神经功能损伤,通常会导致受伤节段以下的肢体严重功能障碍。相关研究发现白藜芦醇具有明确的抗脊髓损伤的作用[5-8],但作用机制尚不明确。本研究采用网络药理学的方法对白藜芦醇抗脊髓损伤的作用机制进行分析。网络药理学是利用生物信息学和药理学揭示药物与疾病的相互作用。本研究共获得白藜芦醇抗脊髓损伤作用靶点48个,筛选出关键作用靶点8个,即AKT1、TNF、VEGFA、IL-1B、IL-6、JUN、CASP3、HIF1A。KEGG通路分析,富集显著的通路主要有:TNF 信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路及MAPK信号通路等。表明白藜芦醇主要通过上述靶点和通路发挥对脊髓损伤的治疗作用。另外本研究根据白藜芦醇抗脊髓损伤作用靶点蛋白相互作用的PPI网络图中度中心性的大小,共筛选出关键作用靶点8个,其中排名前三的是AKT1、TNF和VEGFA。

研究表明,脊髓损伤后,活化的胶质细胞会产生多种炎症因子,如肿瘤坏死因子(TNF-α)等。据报道,脊髓损伤后24h内,炎症因子水平显著增加,并且在脊髓损伤后的继发性损伤中起关键作用,导致脊髓脱髓鞘和神经元死亡[12]。TNF-α是淋巴T细胞分泌的促炎细胞因子,在炎症和细胞凋亡等多种过程中发挥重要作用[13]。炎症因子的产生会诱导多种信号转导途径的激活,包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)。而下调各种炎症介质(包括TNF-α、IL-1β和IL-6)表达可减少潜在的炎症损伤[14]。另外,Brunet A等[15]发现AKT或 PI3K/Akt通路与神经元的存活密切相关。脑源性神经营养因子及神经生长因子等可以通过激活AKT而介导或促进神经细胞的存活[16]。Noshita N等[17]发现在缺血性脑损伤或创伤性脑损伤后,神经元中的AKT活性显著增强,与此同时神经元的凋亡明显减少,说明AKT的激活起神经保护作用。胡凌云等[18]发现脊髓损伤后抑制AKT的表达可阻止脊髓损伤后自发性运动功能恢复。Li E等[19]发现激活AKT1可减少脊髓水肿,促进脊髓修复,恢复大鼠脊髓损伤后的行为功能。所以脊髓损伤后,激活的蛋白信号AKT可能是参与脊髓损伤后神经保护和修复的重要环节。VEGF是一种内皮特异性生长因子,在血管生成中起着重要作用。研究证明,在神经系统中,VEGF对神经具有保护作用,促进神经再生并刺激神经元的生长和存活[20]。VEGF信号通路的激活诱导VEGF蛋白表达增加,可以改善局部缺氧微循环环境,减少脊髓损伤继发损伤,并促进运动功能的改善。刘晓阳等[21]发现脊髓损伤后鞘内注射VEGF对大鼠脊髓损伤引起的神经纤维和神经元的变性有保护作用并可恢复损伤神经的部分功能。

随后,笔者复制了脊髓损伤大鼠模型,对排名前三的关键作用靶点:AKT1、TNF和VEGFA进行实验验证。结果表明,与溶媒组相比,白藜芦醇对脊髓损伤后大鼠运动功能具有明显改善作用,并明显降低TNF mRNA表达(P<0.01),升高AKT1、VEGF mRNA表达(P<0.01)。表明白藜芦醇通过这些重要靶点发挥抗脊髓损伤作用。后续还需要进行进一步的实验和临床验证来证实本研究的发现。

总之,本研究通过网络药理学分析阐明了白藜芦醇对脊髓损伤的药理作用。共有48个靶基因,其中AKT1、TNF、VEGFA是白藜芦醇抗脊髓损伤的关键靶蛋白。GO和KEGG功能富集表明,白藜芦醇靶向蛋白主要富集于TNF 信号通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路等。这表明白藜芦醇主要通过上述靶点和通路发挥对脊髓损伤的治疗作用。本研究可为脊髓损伤中白藜芦醇的进一步研究提供理论基础。