Tob1通过诱导自噬抑制肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖促进细胞凋亡的机制研究

李小亮 伦瑞花

1 河南省焦作市第二人民医院 454001; 2 焦作市妇幼保健院

肾上腺皮质癌(Adrenocortical carcinoma,ACC)是一种罕见的发生于肾上腺皮质的恶性肿瘤,侵袭性强并易发生转移,患者的5年生存率仅有5%～10%[1]。目前,该肿瘤的治疗方法有手术、放疗、化疗以及分子靶向治疗[2]。其中,分子靶向治疗作为一种新型方法在ACC的治疗中显现出了巨大的潜力。寻找新的治疗靶点,探索其分子机制,在ACC的治疗中具有重要意义。

Tob1(Transducer of ErbB2.1)是细胞异位基因ErbB2转录因子抗增殖蛋白家族成员,在乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌等多种癌症中发挥肿瘤抑制的作用[3-4]。最新在胃癌的研究中发现Tob1对细胞自噬有诱导作用[5]。笔者的前期研究发现Tob1在肾上腺皮质癌患者中表达偏低,但其影响ACC的具体分子机制尚未明确。本研究拟探讨Tob1在肾上腺皮质癌中对细胞自噬的作用,以明确Tob1对ACC肿瘤抑制作用的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人肾上腺皮质癌细胞株SW-13购于美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC);胎牛血清、DMEM、F12培养基购于美国Gibco公司;载体pcDNA3.1购于美国Invitrogen公司;3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)购于美国Sigma公司;PCR引物购于上海生工生物工程有限公司;蛋白一抗和二抗购于美国Abcam公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和分组处理:SW-13细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基中,置于37 °C,5% CO2培养箱中培养。2～3d传代一次,取对数生长期细胞进行分组培养。空载质粒(pcDNA3.1)或Tob1过表达质粒(pcDNA3.1-Tob1)采用LipofectamineTM3000试剂转染SW-13细胞。细胞分为3组:对照组(control),正常培养的SW-13细胞;空载质粒对照组(pcDNA3.1),SW-13细胞转染空载质粒pcDNA3.1;pcDNA3.1-Tob1质粒转染组(pcDNA3.1-Tob1),SW-13细胞转染质粒pcDNA3.1-Tob1。后续自噬抑制剂处理组(pcDNA3.1-Tob1+3-MA),在pcDNA3.1-Tob1质粒转染的SW-13细胞中加入5mmol/L的自噬抑制剂3-MA处理。

1.2.2 实时荧光定量PCR:采用TRIzol试剂提取各组SW-13细胞总RNA进行反转录合成模板cDNA。采用SYBR Green进行qRT-PCR。反应体系(20μl)为9μl SYBR Green Mix,2μl上游引物,2μl下游引物和dd H2O。反应条件为95℃ 10min;95℃ 15s,54℃ 10s,72℃ 30s,30个循环;最后在72℃下延伸5min。引物信息如下:Tob1上游引物5’-CTTCAGGAGGTGTTCAC-3’,下游引物5’-AACCTTTACCACTGCCACTT-3’;GAPDH上游引物5’-AGCCACATCGCTGAGACA-3’,下游引物5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’。以GAPDH 为内参基因,用 2-ΔΔCt计算 Tob1 mRNA 表达量。

1.2.3 Western blot检测蛋白表达:采用RIPA细胞蛋白裂解液裂解各组SW-13细胞,提取细胞总蛋白,使用BCA试剂盒测定蛋白浓度。同等量蛋白经SDS-PAGE电泳后,进行电转膜,随后用5%脱脂奶粉室温封闭2h。加入Tob1、LC3、Beclin-1、p62和GAPDH蛋白一抗在4℃孵育过夜,漂洗后加入二抗室温孵育1h。滴加ECL化学发光液,凝胶成像分析系统成像,结果采用ImageJ图像处理软件分析,以GAPDH为内参,检测目的蛋白相对表达水平。

1.2.4 LC3免疫荧光检测:在各组SW-13细胞中加入多聚甲醛固定15min。加入5% 牛血清蛋白后室温封闭1h,按说明加入稀释的LC3蛋白一抗 4℃过夜,随后加入二抗室温孵育1h。最后在荧光显微镜下观察并记录细胞的荧光状况。

1.2.5 CCK-8检测细胞增殖:在各组SW-13细胞中加入将CCK-8试剂与细胞培养基以1∶10混合形成的培养液,37°C孵育4h,用酶标仪在490nm波长处测量吸光值(A值),计算细胞增殖率。

1.2.6 Tunel检测细胞凋亡:在待测SW-13细胞加入4%多聚甲醛固定30min。随后加入50μl Tunel反应混合液避光孵育1h,PBS漂洗后再加入50μl DAPI反应15min。最后置于荧光显微镜下观察凋亡细胞。

1.3 统计学方法 实验数据采用 Graphpad Prism 7.01统计软件分析,结果以平均值±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差(one-way ANOVA)分析及Bonferroni检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 pcDNA3.1-Tob1转染人肾上腺皮质癌细胞SW-13后Tob1表达显著上调 采用Tob1过表达质粒转染人肾上腺皮质癌SW-13细胞,qRT-PCR和western blot结果如图1所示,与control组相比,Tob1的mRNA和蛋白表达在pcDNA3.1-Tob1组中上调,差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 转染pcDNA3.1-Tob1对SW-13细胞中Tob1表达的影响

2.2 pcDNA3.1-Tob1转染影响人肾上腺皮质癌细胞SW-13中自噬蛋白的表达 如图2所示,与对照组相比,pcDNA3.1-Tob1组中LC3-Ⅰ蛋白表达显著下降,LC3-Ⅱ蛋白表达显著提升,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,差异有统计学意义(P<0.05)。同时pcDNA3.1-Tob1质粒的转染显著下调SW-13细胞中p62的表达,上调Beclin1的蛋白表达(P<0.05)。

图2 转染pcDNA3.1-Tob1对SW-13细胞中自噬蛋白表达的影响

2.3 pcDNA3.1-Tob1转染促进人肾上腺皮质癌细胞SW-13自噬 LC3免疫荧光检测SW-13细胞自噬水平,结果如图3所示,control组中绿色荧光斑点较少,而在pcDNA3.1-Tob1组中能观看到明显的绿色荧光斑点聚集,表明pcDNA3.1-Tob1质粒的转染显著上调了SW-13细胞自噬水平。

图3 转染pcDNA3.1-Tob1对SW-13细胞自噬的影响

2.4 Tob1通过促进自噬抑制人肾上腺皮质癌细胞SW-13增殖 采用自噬抑制剂3-MA处理pcDNA3.1-Tob1转染的SW-13细胞。如图4所示,pcDNA3.1-Tob1质粒的转染显著抑制SW-13细胞增殖。同时与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞增殖明显提升(P<0.05)。

图4 3-MA对pcDNA3.1-Tob1转染的SW-13细胞增殖的影响

2.5 Tob1通过促进自噬提升人肾上腺皮质癌细胞SW-13凋亡 如图5所示,pcDNA3.1-Tob1质粒的转染显著提升SW-13细胞凋亡。与pcDNA3.1-Tob1组相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA组细胞凋亡下降,差异有统计学意义(P<0.05)。

图5 3-MA对pcDNA3.1-Tob1转染的SW-13细胞凋亡的影响

3 讨论

肾上腺皮质癌作为一种内分泌型恶性肿瘤,进展快,病死率高[6]。探索肾上腺皮质癌发生发展的分子机制、研发新型治疗方式是该疾病的防治工作重点。随着对肿瘤生物学行为认识的不断深入,细胞死亡在包括肾上腺皮质癌在内多种癌症中的作用越来越受到研究者重视[7-8]。细胞自噬是程序性细胞死亡的一种,通过溶酶体吞噬细胞器、蛋白质等造成细胞死亡,该过程广泛存在于多种疾病的病理进程中,在肿瘤的发生发展中也发挥重要作用[9-10]。已有研究显示,在肾上腺皮质癌中低表达的抑癌基因Tob1在胃癌中能激活细胞自噬[5]。据此,笔者通过转染含有Tob1的表达载体pcDNA3.1-Tob1至人肾上腺皮质癌细胞SW-13,探讨Tob1在SW-13细胞中对自噬的作用以及对人肾上腺皮质癌细胞的影响。

本研究首先对转染了pcDNA3.1-Tob1的SW-13细胞中的Tob1表达进行测定,结果表明与正常SW-13相比,转染pcDNA3.1-Tob1质粒的细胞中Tob1的mRNA和蛋白表达均显著提升,表明该质粒能在SW-13细胞中有效过表达Tob1。LC3是检测自噬活性的标志性蛋白。自噬过程中胞质内的Ⅰ型LC3蛋白在经过泛素样加工修饰后,结合磷脂酰乙醇胺形成脂溶性的Ⅱ型LC3蛋白,进而参与自噬泡膜的延伸,并促进自噬体的成熟[11]。衔接蛋白p62可与LC3相互结合,转染至自噬体后降解,与自噬的活性呈负相关[12]。Beclin 1是自噬调节的关键因子之一,可招募自噬相关蛋白促进自噬前体形成[13]。本研究结果显示,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1在Tob1过表达的SW-13细胞中显著上调,p62蛋白表达显著下调。进一步通过免疫荧光法检测得出Tob1过表达显著提升SW-13细胞的自噬水平,与在胃癌中结果一致。

3-MA是一种经典的自噬抑制剂,能够通过抑制Class PI3K-Ⅲ,阻止自噬体的形成,进而抑制细胞内自噬的发生[14]。为了研究Tob1对自噬的促进作用对人肾上腺皮质癌细胞的影响,笔者在Tob1过表达的SW-13细胞中加入自噬抑制剂3-MA处理。本研究结果显示,Tob1的过表达显著抑制了SW-13的细胞增殖,促进细胞凋亡,与笔者前期在人肾上腺皮质癌细胞H295R中的结果相一致。同时与pcDNA3.1-Tob1质粒转染组相比,3-MA的加入提升了SW-13细胞增殖,抑制细胞凋亡,表明Tob1在SW-13细胞中发挥的抑癌基因作用是通过激活自噬产生的。

综上所述,Tob1可通过激活细胞自噬抑制人肾上腺皮质癌细胞SW-13的细胞增殖,并促进其凋亡,为Tob1作为分子靶标应用于人肾上腺皮质癌的治疗提供了理论依据和实验基础。