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灵猫方调控HBV相关免疫应答的机制研究*

2023-12-25朱晓骏唐亦非高月求

中西医结合肝病杂志 2023年12期
关键词:方组质粒小鼠

崔 怡 朱晓骏 尚 志 方 淼 唐亦非 高月求△

1.上海中医药大学附属曙光医院 (上海, 201203) 2.上海中医药大学曙光临床医学院

慢性乙型肝炎(CHB)目前仍然是全球性公共卫生问题。据统计,全球有2.57亿人为慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者,是肝硬化、肝细胞癌(HCC)和肝病相关死亡的主要危险因素,每年约88.7万人死于HBV相关疾病[1-3]。中国是世界上HBV感染负担最重的国家,1~59岁人群中HBV表面抗原(HBsAg)的总体携带率为7.18%,相当于有9 300万HBV携带者[4],约60%肝硬化患者和75%肝癌患者是由HBV感染引起的[5,6]。现有的抗病毒药物虽能有效抑制病毒复制,但无法彻底清除肝细胞中的HBV cccDNA,很难达到临床治愈[7,8]。中草药及其活性成分以其独特的优势在治疗CHB方面发挥重要作用,具有广阔的应用前景[9]。灵猫方是上海中医药大学附属曙光医院肝病科治疗CHB的有效验方。前期研究发现,灵猫方可有效改善CHB患者的临床证候,提高患者的生化指标和抗病毒应答反应,增强免疫应答[10-13]。

1 材料与方法

1.1 实验动物 C57BL/6N雄性小鼠,3周龄,30只,SPF级,购于北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司[实验动物生产许可证编号SCXK(浙)2019-0001,实验动物使用许可证编号SYXK(沪)2017-0014,实验动物合格证编号20211012Abzz0619000774]。本研究在北京维通利华实验动物技术有限公司上海分公司SPF级饲养室进行动物饲养、造模与观察。所有实验均遵照国家相关实验动物的使用、福利和伦理学要求等规定。

1.2 药物与试剂 ①实验药物:灵猫方由仙灵脾、女贞子、黄芪、猫爪草各15 g,胡黄连、青皮各9 g组成。根据前期实验基础,以人鼠剂量9.1倍换算,按照11.83 g/kg剂量灌胃给药。所用药物均为中药配方颗粒,由江阴天江药业有限公司生产(生产批号:仙灵脾20056134、女贞子21066074、黄芪20116104、猫爪草19076164、胡黄连20092211、青皮21046274)。②试剂: PrcccDNA ShB2m、pCMV-Cre质粒为本实验室所有;大肠杆菌DH5α为本实验室保存;无内毒素质粒大提试剂盒(TIANGEN,货号 DP117);IFNα试剂盒(GenXspan,货号GXP557484);F4/80抗体(abcam,货号 ab111101);DAB显色液(迈新,货号 DAB-2031);EDTA抗原修复液(迈新,MVS-0099);过氧化物酶阻断剂(Biotechnologies,货号SP KIT-A3)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列见表1。

表1 PCR引物序列(5′to 3′)

1.3 实验方法

1.3.1 HBV小鼠模型构建及分组情况 PrcccDNA ShB2m及pCMV-Cre质粒均用无内毒素质粒大提试剂盒制备,质粒制备方法如下:两种质粒分别转染大肠杆菌DH5α,从转染的细菌平板中挑取生长良好的单菌落接种于LB液态培养基,37℃、220 r/min振荡培养过夜,其中转染PrcccDNA ShB2m的细菌使用含50 μg/ml氨苄青霉素的培养基,转染pCMV-Cre的细菌使用含50 μg/ml卡那霉素的培养基。菌液4℃离心,弃上清后依次加入溶液P1、P2、P3,QF缓冲液洗脱,异丙醇沉淀,100%乙醇清洗并溶于TE缓冲液,即可获取无内毒素的高浓度质粒。采用水动力转染技术建立HBV小鼠模型,将小鼠按照随机数字表法分为3组,模型组和灵猫方组小鼠尾静脉高压水注射1.5 ml含6 μg PrcccDNA ShB2m及pCMV-Cre质粒的生理盐水,正常组小鼠注射等量生理盐水。第3天采集小鼠眼眶静脉血,Elisa检测分析血清中HBsAg、HBeAg水平。灵猫方组小鼠按10 ml/kg剂量灌胃,2次/d;模型组和正常组小鼠以等体积饮用水灌胃,连续灌胃3 d。

1.3.2 标本留取 第3天灌胃结束后禁食12 h,用2%戊巴比妥钠3 ml/kg腹腔注射麻醉,经眼眶静脉丛采血,3 000 r/min离心15 min后吸取血清,-80℃低温保存。打开腹腔,从门静脉灌注生理盐水冲洗肝脏,在同一肝叶位置切取一小块组织,置入10%中性多聚甲醛中固定;另切取一小块肝组织分装于离心管中-80℃低温保存;剩余肝组织研磨,4℃、400 g离心15 min后弃上清,沉淀用Percoll混匀,850 g梯度离心25 min,设置提速加速度为9、减速加速度为0,沉淀加入2 ml红细胞裂解液室温放置3~5 min,4℃、400 g离心7 min后弃上清,即可得到肝脏免疫细胞,-80℃低温保存。

1.3.3 检测指标与方法 (1)Elisa检测血清HBsAg、HBeAg、IFNα水平:血清HBsAg、HBeAg水平委托上海中医药大学附属曙光医院检验科检测。IFNα水平按照Elisa检测试剂盒说明书操作,取出血清并稀释,标准品孔加入50 μl不同浓度(2 000、1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)的标准品,设置待测样本孔及空白孔,除空白孔外其余各孔加入酶试剂,封板温育后重复洗涤5次,显色,加入终止液后测定各孔的吸光度(OD值)。(2)IHC检测肝组织F4/80蛋白表达:石蜡切片脱蜡,PBS洗3次加入EDTA抗原修复液,微波高火2 min、低火15 min修复抗原,自然冷却至室温后PBS洗3次,滴加3%过氧化氢以阻断内源性过氧化物酶活性,PBS洗3次后10% BSA封闭60 min,滴加F4/80一抗(1∶500)4℃孵育过夜, PBS洗3次,滴加二抗(1∶200)室温孵育60 min,PBS洗3次,DAB显色,苏木精染核,自来水冲洗,梯度乙醇脱水,树脂封片,显微镜下观察,采用Image J 软件统计F4/80积分吸光度(IA)。(3)实时荧光定量PCR检测肝组织TNFα、IL-1β、IL6 mRNA表达:称取50 mg肝组织,加入500 μl RLS裂解液,全自动研磨仪匀浆90 s,RNA快速提取试剂盒提取总RNA,逆转录获取cDNA,实时荧光定量PCR检测TNFα、IL-1β、IL-6、β-actin mRNA,采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。(4)蛋白质组学检测:肝免疫细胞加入蛋白裂解液500 μl,冰上裂解30 min,4℃、12 000 r/min离心10 min,取上清,BCA法测定蛋白浓度;二硫苏糖醇56℃还原30 min,碘代乙酰胺室温避光孵育15 min,37℃酶解过夜;Strata X C18(Phenomenex)除盐,TEAB溶解,乙腈标记,室温孵育2 h,重复除盐后真空冷冻干燥;高pH反向HPLC分级处理60 min,真空冷冻干燥;液相色谱-质谱联用分析,Maxquant检索质谱数据。

2 结果

2.1 灵猫方对实验小鼠血清HBsAg、HBeAg滴度和IFNα水平的影响 与模型组比较,灵猫方干预3 d后,灵猫方组小鼠血清HBsAg、HBeAg滴度明显下降(P<0.05,P<0.01),IFNα水平显著上升(P<0.01)。见图1,图2。

图2 灵猫方对实验小鼠血清IFNα水平的影响 (*P<0.01)

2.2 灵猫方对实验小鼠肝组织F4/80蛋白表达的影响 与正常组比较,模型组小鼠肝组织F4/80蛋白表达量明显升高(P<0.01);与模型组比较,灵猫方组小鼠肝组织F4/80蛋白表达量明显降低(P<0.01)。见图3。

图3 灵猫方对实验小鼠肝组织F4/80蛋白表达的影响 (*P<0.01)

2.3 灵猫方对实验小鼠肝组织TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响 与正常组比较,模型组小鼠肝组织TNFα、IL-1β、IL-6mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.001);与模型组比较,灵猫方组小鼠肝组织TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA 表达明显降低(P<0.01)。见图4。

图4 灵猫方对实验小鼠肝组织TNFα、IL-1β、IL-6 mRNA表达的影响 (*P<0.01)

图6 实验小鼠肝脏免疫细胞差异蛋白KEGG通路富集分析

图7 实验小鼠肝脏免疫细胞差异蛋白表达定量分析

2.4 灵猫方对实验小鼠肝脏免疫细胞蛋白质组的影响 对模型组及灵猫方组小鼠肝脏免疫细胞质谱数据进行生物信息学分析,GO分析显示,差异蛋白显著富集于代谢相关功能,包括脂代谢;KEGG通路富集分析显示,差异蛋白显著富集于PPAR通路;差异蛋白表达定量分析显示,与模型组比较,灵猫方组免疫细胞的代谢能力下降,天然免疫应答上升。见图5~7。

3 讨论

灵猫方以仙灵脾、女贞子为君,温而不悍,补而不腻,并补肾之阴阳[14];猫爪草、胡黄连为臣,清化肝经湿热疫毒;黄芪为佐,补益后天脾气,助君药培养先天,并使补而不滞;青皮为使,引诸药入足厥阴之经。前期研究表明,灵猫方可促进pHBV1.3质粒转染HepG2细胞的Ⅰ、Ⅲ型干扰素(IFN)表达,增强固有免疫功能[9];灵猫方可提高CHB患者外周血NK细胞数量及其胞内外TLR3的表达水平,调节机体免疫功能[12]。

CHB免疫发病机制十分复杂,至今尚未完全阐明[15,16]。脂质代谢已被证明在抗病毒反应中发挥重要作用[17],代谢过程的转录调控是早期Ⅰ型IFN反应的关键特征,IFN-α的生成与巨噬细胞参与胆固醇合成的基因下调有关[18]。本研究结果提示,灵猫方促进HBV感染小鼠IFNα分泌,降低HBsAg、HBeAg滴度;蛋白组学分析显示,灵猫方可抑制免疫细胞代谢,提高天然免疫应答。据此推测,灵猫方可能通过抑制免疫细胞脂质代谢,促进IFNα分泌,从而降低HBV相关血清标志物的表达。

巨噬细胞脂依赖脂肪酸氧化途径获取能量,通过激活活性氧和NLRP3炎症小体分泌IL-1β等促炎因子[19]。PPAR主要分布在肝脏、肠道及心脏组织,诱导线粒体脂肪酸氧化的限速酶CPT-1表达,增强线粒体对脂肪酸的利用和氧化[20],同时,PPAR在抑制炎症因子生成方面亦发挥着重要作用[21]。本研究结果提示,灵猫方可降低HBV感染小鼠肝组织F4/80蛋白表达,抑制TNFα、IL-1β、IL-6等促炎因子的释放;蛋白组学分析显示,差异蛋白显著富集于PPAR通路。据此推测,灵猫方可能通过作用于PPAR信号通路,降低巨噬细胞表达,抑制促炎因子的释放。

综上,灵猫方可能通过作用于PPAR信号通路,参与免疫细胞脂质代谢重编程,进而增强HBV相关免疫应答,同时抑制促炎因子的释放。本研究为灵猫方调控HBV相关免疫机制提供了一定的实验依据,为该方今后应用于CHB的临床治疗提供科学证据,具体的药理机制有待于进一步探究。

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