酒炙对柴胡总黄酮以及皂苷类成分的影响

2023-12-24李雪仪彭东辉陈雨婵姜帆秦安琪曾元宁匡海学王秋红

广东药科大学学报 2023年6期

李雪仪，彭东辉，陈雨婵，姜帆，秦安琪，曾元宁，匡海学，王秋红

（1.广东药科大学中药学院/广东省中药饮片规范化炮制工程技术研究中心，广东广州 510006；2.黑龙江中医药大学药学院/教育部北药基础与应用研究重点实验室/黑龙江中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江哈尔滨 150040）

柴胡在《中国药典》中收录为伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，按照2种不同种植物的性状不同，前者习惯称之为“北柴胡”，后者习称“南柴胡”。柴胡性味微苦、微辛、微寒，具有退热解表、疏肝解郁、截疟等功效[1-3]。现代研究发现，柴胡主要含有黄酮、皂苷、多糖以及挥发油等物质[4]，在具有抗肿瘤、抗抑郁症和抗纤维化、抗衰老作用，对肝、肺损伤的保护作用的同时，还有保护心脏、肝脏和肾脏等作用[5-13]。

柴胡的炮制方法有酒制、蜜制、醋制、鳖血制等，酒炙柴胡的应用历史可追溯到《原机启微》，附方[14]中提到：“泻热黄连汤治内障，症同上，有眵泪，黄芩（酒炒）、黄连（酒洗）、柴胡（酒炒）、生地黄（酒洗，各一两）、升麻（半两）、龙胆草（三钱）”，酒炙后能增强柴胡行血通经、疏肝解郁的作用[15]，柴胡酒炙方法在《全国中药饮片炮制规范（一）（征求意见稿）》及部分地方炮制规范中有收录[16]。目前柴胡研究较多的炮制方法是醋炙法和鳖血制法，关于酒炙法以及酒炙法对柴胡化学成分及药理作用影响的研究较少。邱云等[17]研究发现酒炙后会降低柴胡中SSa和SSd质量分数，李小宁等[18]研究发现酒炙能减少柴胡总多糖的质量分数，叶耀辉等[19]提出酒法炮制后柴胡挥发性成分在总柴胡检出物中比例升高。酒炙后的柴胡对血瘀证模型大鼠的血液流变学指标和凝血四项指标的改善作用更强[20]，增强了活血行气作用；酒炙后柴胡能更大范围地提高虚热大鼠的D-木糖值，侧重于提高机体免疫能力[21]，该效果较生柴胡更显著。现行研究多关注醋炙柴胡对柴胡功效的影响或炮制对柴胡的总体影响，酒炙对柴胡的影响较少单独出现，并且对酒炙柴胡所造成的影响及其原因没有进一步研究。本试验在现行柴胡总黄酮和柴胡各皂苷测定方法的基础上，研究柴胡酒炙前后总黄酮以及柴胡皂苷类成分质量分数变化，为后续柴胡酒炙的研究提供参考依据。

1 材料与仪器

1.1 药材

生柴胡片购于广州清平药材市场，经广东药科大学中药学院中药资源系刘基柱教授鉴定为伞形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根，属北柴胡。药材共9 批，产地为黑龙江、甘肃和内蒙古，由实验室自行炮制加工，详细信息见表1。

表1 9批柴胡药材信息表Table 1 The information of 9 batches of radix bupleuri

1.2 试剂

柴胡皂苷a（SSa，批号：J0901 AS）、柴胡皂苷b1（SSb1，批号：A1130 AS）和柴胡皂苷b2（SSb2，批号：A0319 AS）购自大连美仑生物技术有限公司，质量分数≥98%，柴胡皂苷d（SSd，批号：B20150）和芦丁（批号：B20771）购自上海源叶生物科技有限公司，质量分数≥98%。乙腈购自赛默飞世尔科技公司，为色谱纯；甲醇、氨水购自天津市大茂化学试剂厂，均为分析纯。

1.3 仪器

ACQUITY Arc 型超高效液相色谱仪、2489 UV型紫外检测器（美国Waters 公司），MX-F 型涡旋器（美国Scilogex 公司），CA-1330 型冷却水循环装置、SB-1300 型水浴锅（上海爱朗仪器有限公司），SB25-12 DTD 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），H1750 R 型高速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），ME802/104 E 型电子分析天平［梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司］，N-1300 型旋转蒸发仪（日本EYELA 公司），AllegraX-15R 型台式离心机（美国贝克曼库尔特有限公司）。

2 方法

2.1 柴胡饮片的制备

根据《湖北省中药饮片炮制规范（2018 年版）》[22]所载，取净柴胡片适量，加10%（体积分数，下同）黄酒拌匀，于室温中闷透，等待酒液被吸尽后，置于炒制容器内，用文火将其炒干，取出后放凉，打粉，过4号筛，即得生柴胡粉末和酒柴胡粉末。

2.2 柴胡酒炙前后总黄酮成分质量分数的测定

2.2.1 对照品溶液的制备称取50 mg干燥至恒重的芦丁对照品，置于25 mL 容量瓶中，加入适量甲醇，水浴加热溶解，放冷，加入甲醇定容至容量瓶刻度，摇匀，即得[23]。

2.2.2 供试品溶液的制备取各批次的生柴胡和酒柴胡粉末（过4号筛）各200 mg，称定，置于具塞锥形瓶中，加入75%甲醇4 mL，超声处理（功率800 W，频率40 kHz）20 min，离心10 min（转速4 750 r/min）。如上再次重复提取2 次，每次都加入75%甲醇3 mL，合并3 次上清液，转移至10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，分别作为生柴胡和酒柴胡粉末的供试品溶液。

2.2.3 标准曲线的绘制参考周亚福等[24-25]的方法，将“2.2.1”项下制备的对照品溶液分别稀释，配置成质量浓度分别为0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 mg/mL 的芦丁对照品溶液。分别量取7 份上述质量浓度的对照品溶液1 mL 于7 个10 mL 具塞试管中，依次加入60%甲醇溶液3.0 mL以及5%亚硝酸钠溶液0.4 mL，摇匀，放置6 min，再加入10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀后再次放置6 min，加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL，摇匀后放置15 min，以等体积蒸馏水为空白对照，同时以1 mL黄酒代替供试品溶液，重复上述步骤重复测定3次，以消除黄酒本身的影响，在510 nm 处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标（Y），总黄酮质量浓度为横坐标（X）绘制标准曲线，得到回归方程：Y=0.077 2X-0.008 2（r=0.999 5）。

2.2.4 总黄酮质量分数的测定取“2.2.2”项下供试品溶液，按“2.2.3”项下方法测定各供试品的吸光度值，代入回归方程，计算得生柴胡和酒柴胡粉末中总黄酮的质量分数，结果见表2。通过t检验可知2 种柴胡总黄酮质量分数差异具有统计学意义（P<0.05），证明酒炙后柴胡总黄酮质量分数升高。

表2 各批次柴胡中总黄酮的质量分数Table 2 Mass fraction of total flavonoids in different batches of radix bupleuri(,n=3) w/（mg·g-1）

2.3 柴胡酒炙前后皂苷类成分质量分数的测定

2.3.1 对照品溶液的制备分别取SSa、SSb1、SSb2 和SSd 对照品适量，精确称定，置于5 mL 容量瓶中，分别加入甲醇制成每1 mL 含SSa 10 mg、SSd 10 mg、SSb1 1 mg、SSb2 1 mg 的各对照品溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备参考黄江等[26]的方法，分别取各批次生柴胡和酒柴胡粉末0.5 g，称定，置具塞锥形瓶中，加入5%浓氨甲醇25 mL，密塞，超声（功率500 W、频率40 kHz）30 min。取出，放冷，用甲醇20 mL分3次洗涤药渣以及容器，合并洗液及滤液回收溶剂至蒸干，残渣加甲醇使溶解，转移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，定容，摇匀，即得。

2.3.3 色谱条件色谱柱为SunFireC18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流动相为乙腈（A）和水（B），以梯度方式洗脱（0～60 min，25%A→58%A）；SSb1 和SSb2 的检测波长为254 nm，SSa 和SSd 的检测波长为210 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃[27-29]，进样量为10 μL。

2.3.4 线性关系的考察分别吸取SSa、SSb1、SSb2、SSd 对照品溶液，分别稀释至表3 中的质量浓度。按照“2.3.3”项下色谱条件进样测定，以质量浓度（X）为横坐标，峰面积值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，结果线性关系良好，回归方程见表4。

表3 4种成分对照品溶液的质量浓度Table 3 Mass concentration of reference solutions for SSa，SSb1，SSb2 and SSd mg/mL

表4 线性关系考察结果Table 4 Results of linear relationship investigation

2.3.5 专属性试验分别精密称取SSa、SSb1、SSb2、SSd适量，置于5 mL 容量瓶中，加入甲醇制成SSa、SSb1、SSb2、SSd 质量浓度分别为0.02、0.09、0.09、0.2 mg/mL 的混合对照品溶液。以甲醇为阴性对照溶液。

分别精密吸取生柴胡和酒柴胡供试品溶液（S1）、混合对照品溶液、阴性对照溶液，分别按照“2.3.3”项下方法进样测定，结果见图1。从图1 可知，254 nm 处SSb1 和SSb2 互不干扰，210 nm 处SSa和SSd 亦互不干扰，且阴性无干扰，方法专属性良好[30]。

图1 生柴胡粉末供试品溶液（S1）、酒柴胡粉末供试品溶液（J1）和混合对照品溶液的HPLC色谱图Figure 1 H PLC chromatograms of Raw Bupleurum chinense test solution（S1），alcoholic bupleurum chinense test solution（J1）and mixed standard solution

2.3.6 精密度试验精密吸取同一批生柴胡粉末（S1），按“2.3.3”项下方法重复进样6 次，测得SSa、SSb1、SSb2、SSd 峰面积的RSD 值分别为0.34%、0.51%、0.84%和0.81%，表明方法精密度良好[30]。

2.3.7 重复性试验取同一批生柴胡粉末（S1）6份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样10 μL，按“2.3.3”项下方法测定。得到SSa、SSb1、SSb2、SSd 质量分数的RSD 值分别为0.16%、0.43%、0.10%和0.11%，表明方法重复性良好[30]。

2.3.8 稳定性试验取同一批生柴胡粉末（S1）0.5 g，精密称定，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、12、24、48 h 后依次进样，按“2.3.3”项下方法测定，计算得到SSa、SSb1、SSb2、SSd峰面积的RSD值分别为0.36%、0.84%、0.84%和0.90%，结果显示供试溶液中各待测成分在48 h 内基本稳定[30]。

2.3.9 加样回收率试验取已知质量分数的生柴胡粉末（S1）6 份，分别加入SSa（0.6 mg/mL）、SSb1（0.004 mg/mL）、SSb2（0.01 mg/mL）、SSd（1.0 mg/mL）对照品溶液1 mL，进样量10 μL，按“2.3.3”项下方法测定各柴胡皂苷的质量分数，平行测定3次，表明样品的加样回收率良好[30]。见表5。

表5 4种成分加样回收率试验结果Table 5 The results of recovery rate of 4 components

2.3.10 样品中皂苷类化合物质量分数的测定分别取各批次的柴胡生品和酒炙品的供试品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下色谱条件进样，平行测定3 次，见图2。通过回归方程计算炮制前柴胡中SSa、SSb1、SSb2、SSd 的质量分数，SSb1 的定量限为0.001 mg/mL，结果如表6－8所示。通过t检验可知酒炙能使SSa 和SSd 的质量分数减少（P<0.05），SSb1 和SSb2 的质量分数增加（P<0.05）。

图2 柴胡炮制前后的HPLC色谱图Figure 2 HPLC chromatograms of radix bupleuri before and after processing

表6 柴胡生品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的质量分数Table 6 The contents of SSa，SSb1，SSb2 and SSd in crude bupleurum chinense DC(,n=3) w/(mg·g-1)

表7 柴胡酒炙品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的质量分数Table 7 The contents of SSa，SSb1，SSb2，SSd in radix bupleuri stir-fried in wine(,n=3) w/(mg·g-1)

表8 柴胡中4种成分质量分数的t检验结果Table 8 T-test results of the mass fractions of four components in radix bupleuri

3 讨论

本试验通过比较酒炙前后柴胡中总黄酮、皂苷类成分质量分数的变化来研究酒炙法对柴胡化学组成的影响。结果显示，柴胡酒炙后总黄酮成分质量分数升高，其原因可能与辅料黄酒以及加热情况下化学成分的结构转化有关，具体机制有待进一步研究。此外，有研究报道柴胡中的总皂苷质量分数为酒柴胡>生柴胡>醋柴胡[31]，本研究发现经酒炙后，SSa 和SSd 的质量分数减少，原因可能是生柴胡在润洗和浸润前处理的过程中，皂苷成分随着水的冲洗而流失减少[32]，与本实验结果一致；同时，SSa、SSd 中的C13、28 位的有氧醚环在加热过程中不稳定，易开环[31]，其中SSa 可以转化生成SSb1[34]，SSd转化生成SSb2[33]，导致SSb1、SSb2 质量分数增加。但是过程是否定量、转化的影响因素等还需要进一步研究。

经前期研究得知，柴胡酒炙之后可增强升举阳气、活血行气等功效，但是其化学成分变化以及对功效的影响还没有深入研究，后续可进一步研究酒炙法对柴胡功效的影响，从而阐明柴胡酒炙的科学内涵。