贵州省自然保护区中华蜜蜂形态及mtDNA遗传多样性

赵金玉,吴育滔,龙见坤,陈祥盛,常志敏,3

(1.贵州大学昆虫研究所,贵阳 550025; 2.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室 动物科学学院,贵阳 550025; 3.贵州大学昆虫资源开发利用省级特色重点实验室,贵阳 550025)

种群遗传分化现状是种质资源保护及开发利用的基础,形态遗传标记法及mtDNA标记法是研究蜜蜂遗传分化的主流方法。形态遗传标记法因具有形象直观、节约成本等优点,常结合主成分分析、聚类分析、关联分析等方法,广泛应用于蜜蜂种群形态分化及分化机制研究[1-4]。mtDNA标记法基于蜜蜂线粒体DNA母系遗传的特点,即蜂群中所有工蜂与蜂王具有相同的线粒体DNA,一只工蜂mtDNA便可代表整个蜂群,具有采样量少、操作简单等优点[5],并结合mtDNA碱基组成、遗传距离、系统发育等分析方法,亦被广泛应用于蜜蜂种间遗传分化研究[6-8];尤其mtDNA COⅠ～COⅡ片段或其间部分序列作为有效片段被诸多学者用于蜜蜂遗传分化研究[9-11]。

中华蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius)是我国本土独有的蜜蜂品种,除新疆外,在全国绝大多数地区广泛分布,因其善于利用零星蜜源植物、采集力强且利用率高,特别适合我国南方丘陵及山区饲养[12]。各地中华蜜蜂在进化过程中与当地气候环境相适应,形成了不同的地理生态型。贵州省分布有高原、山地、丘陵等多种地貌类型,森林资源丰富,生境复杂,为饲养中华蜜蜂的优良选地,目前贵州省中华蜜蜂保有量84.35万群,占全国中华蜜蜂总量的12.57%以上,占全省蜂群92.73%,本土中华蜜蜂蜂种与贵州气候环境相适应,主要为华中型和云贵高原型[13]。近年来,贵州省大力发展蜂产业,人工育王普遍,流动放蜂频繁,加之从广东、福建等外地大量引种,造成贵州省本土中华蜜蜂的蜂种资源流失及杂交混乱等问题愈加严重,增加了贵州本土中华蜜蜂蜂种保护难度。自然保护区是保护物种资源的重要分布地,贵州省涵盖国家级、省级及地县各级自然保护区89个,但贵州自然保护区内中华蜜蜂蜂种保护情况关注较少。骆群等[14]和于瀛龙等[15]分别利用形态标记法和微卫星标记法对贵州省中华蜜蜂种群分化情况进行研究,均未发现其存在种群分化,但其样本有限且并未涉及保护区中华蜜蜂蜂群;仅于瀛龙等[16]利用15个微卫星分子标记对梵净山自然保护区的中华蜜蜂遗传分化情况进行了研究,指出该保护区的中华蜜蜂并未产生种群分化,但并未与其他保护区情况进行比较。

本研究通过对贵州省不同自然保护区的中华蜜蜂进行调查,分别选用31个形态特征和mtDNA COⅠ～COⅡ序列为标记对贵州省中华蜜蜂种群分化开展研究以期了解其种群分化现状,为贵州省本土中华蜜蜂种质资源保护和开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

为减少试验误差,采样在蜜源植物丰富、种群群势较强的季节进行,共采集11个野生自然保护区样点蜜蜂,每个样点采集工蜂≥15只,样本采集后无水乙醇保存于-20 ℃冰箱待用,采样点具体分布:草海为威宁县草海国家级自然保护区;佛顶山为石阡县佛顶山自然保护区;雷公山为雷山县雷公山国家级自然保护区;野钟为水城区野钟黑叶猴自然保护区;百里杜鹃为毕节百里杜鹃特色森林资源自然保护区;青岩为花溪青岩油杉自然保护区;宽阔水为绥阳县宽阔水国家级自然保护区;清水河为兴仁市清水河自然保护区;赤水为赤水市桫椤国家级自然保护区;习水为习水市中亚热带常绿阔叶林国家级自然保护区;茂兰为荔波县茂兰国家级自然保护区。具体见图1及表1。

表1 贵州省11个自然保护区中华蜜蜂样本采集信息

图1 贵州省11个自然保护区中华蜜蜂采样点分布

1.2 方法

1.2.1 形态特征测定

每个样点随机抽取10只体重相当的工蜂,参照Ruttner[17]提出的形态学方法,选取喙长(Length of proboscis,LP),右前翅长(Length of forewing,LW),右前翅宽(Width of forewing,WW),右前翅肘脉a(Cubial veina,CA),肘脉b(Cubial veinb,CB),肘脉指数(Cubital index,CI;肘脉a长/肘脉b长),右前翅翅脉角(A4、B4、D7、K19、G18、J10、L13、J16、N23、O26、E9),右后翅钩数(Number of hind wing hook,NH),右后足股节长(Length of femur,LF),右后足胫节长(Length of tibia,LT),右后足跗节长(Length of metatarsus,LM),右后足跗节宽(Width of metatarsus,WM),第3背板长(Length of tergite 3,LT3)及第4背板长(Length of tergite 4,LT4),第4腹板长(Length of sternite 4,LS4),第4腹板斜长(Transverse length of wax plate on sternite 4,TWS4),第4腹板蜡镜长(Length of wax plate on sternite 4,LWS4),第5背板黑带长(Length of tergite black belt 5,LT5),第6背板黑带长(Length of tergite black belt 6,LT6),第7腹板长(Length of sternite 7,LS7)和第7腹板宽(Width of sternite 7,WS7) 等31个形态特征为遗传标记。使用Nikon SMZ25数码成像系统采集图片及测定指标,其中,翅脉角联合使用tpsUtil32和tpsDig232软件进行测定。

1.2.2 总DNA提取

每群中将形态学测量后工蜂样本随机抽取1只[5,7-11],取其胸部,尽量除去外表几丁质,采用动物组织DNA快速提取试剂盒(天根生化科技有限公司)提取总DNA。

1.2.3 序列扩增与测序

基于PCR引物R:5′-CTATACCTCGACGATACTCAG-3′及F:5′-TCAGGGTATTCATAGGATC-3′对mtDNA COⅠ～COⅡ序列进行扩增。PCR反应体系为20 μL,其中,2×TaqMasterMix 10 μL,引物F及R各1 μL,DNA模板2 μL,dd H2O 6 μL。反应程序:94 ℃预变性5 min;95 ℃变性30 s,54 ℃退火30 s,64 ℃延伸30 s,34个循环;72 ℃再延伸5 min。PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。

1.2.4 数据处理

根据经纬度采用Arcgis10.8绘制样点分布图,使用R4.0.2对形态数据平均值进行直接聚类分析及主成分分析[18],使用SPSS 23.0进行方差分析[19]。分子数据使用Mafft 7.205对序列进行比对;运用DNAsp 5.0检测并统计突变位点、单倍型数目及分布[20];使用Mega 6.05计算碱基组成、Kinura 2-Parameter(K2P)平均遗传距离、构建系统发育树等[21];利用Arcgis 10.8 根据各样点的经纬度计算地理距离,并使用SPSS 23.0和Origin 2022b对遗传距离和地理距离进行相关性分析;采用Network 4.61构建单倍型网络中介图[22]。

2 结果与分析

2.1 形态分化

形态聚类分析表明:11个样点主要聚为2个类群,第一类群包括百里杜鹃特色森林资源自然保护区、草海国家级自然保护区及宽阔水国家级自然保护区3个样点;剩余8个样点聚为第二类群,见图2。

形态特征主成分分析结果表明,PC1特征根为4.263,形态特征前翅长、前翅宽、第七腹板长、第七腹板宽、第四腹板长、股节长、喙长等对其贡献率较大,解释总体变异的42.7%。PC2特征根为2.148,形态特征跗节长、跗节宽、第六背板黑带长、后翅钩数、翅脉角D7、翅脉角J16等对其贡献率较大,解释总体变异的28.4%。前2个主成分解释了总体变异的71.1%。利用前2个主成分进行作图,结果见图3。

图3 贵州省11个自然保护区不同群体间中华蜜蜂31项形态特征主成分分析

方差分析结果表明,各样点间中华蜜蜂在第三背板长、第四背板长、第七腹板长等大多数形态指标上均存在差异显著,仅翅脉角D7和G18未达显著差异水平,未发现与样点分布相关,见表2。

表2 贵州省11个自然保护区不同群体间中华蜜蜂31项形态特征方差分析

2.2 MtDNA遗传多样性

通过mtDNA碱基组成及变异情况分析,COⅠ～COⅡ序列总长度为733 bp,A+T平均含量为82%,C+G平均含量18%,A+T偏倚性明显。该片段共检测到变异位点32个,其中,单突变位点15个,分别在第33、70、71、145、146、167、168、200、275、294、295、350、385、630和674碱基上;简约信息位点17个,分别在第 15、16、17、18、19、20、21、27、28、29、30、31、197、290、730、735、736。在该序列中,共检测到11个单倍型,见表3,命名为H1-H11,所有单倍型均为独有单倍型,且将11条序列上传NCBI数据库,登录号分别为ON667711～ON667721。贵州省自然保护区中华蜜蜂平均核苷酸多样度为0.016,核苷酸平均差异数为11.636,平均单倍型多样度1.000。Tajima’s D中性检验和Fu’s Fs中性检验值分别为-1.060和-3.702,见表4。

表3 贵州省11个自然保护区不同群体间中华蜜蜂单倍型分布情况

表4 贵州省11个自然保护区中华蜜蜂mtDNA多样性指数

通过对贵州省11个自然保护区样点mtDNA遗传距离分析表明,11个样点间平均遗传距离介于0.007 0～0.027 0;其中,宽阔水保护区与青岩保护区间遗传距离最大,为0.027 0,赤水保护区与佛顶山保护区间遗传距离最小,为0.007 0,见表5。11个样点间的地理距离在88.56～492.26 km,其中,茂兰保护区和草海保护区地理距离最远,为492.26 km,赤水保护区和习水保护区地理距离最近,为88.56 km,见表6。利用SPSS 23.0和Origin 2022b对地理距离和遗传距离进行相关性分析,结果显示其P值分别为0.299和3.00;上述11个样点间中华蜜蜂的地理距离和遗传距离未发现明显相关性,见图4。

表5 贵州省11个自然保护区中华蜜蜂不同群体间K2P平均遗传距离

表6 贵州省11个自然保护区中华蜜蜂不同群体间采样点的地理距离(km)

图4 贵州省11个自然保护区中华蜜蜂不同群体间地理距离和遗传距离相关性分析

以分布于云南省保山市中华蜜蜂单倍型为外群(登录号为DQ388609,简写YN),基于ML法和NJ法构建的单倍型系统进化树结果基本一致,均显示11个单倍型大致可聚为3个类群,其中,H2、H5、H9和H10聚为第一个类群,H7和H8聚为第二个类群,H1、H3、H4和H11聚为第三个类群,仅H6存在差异,见图5。同样以YN单倍型为外群构建11个单倍型的网络中介图,结果显示11个单倍型聚为3个类群,与基于ML法构建的系统发育树结果一致,见图6。

(a)ML法;(b)NJ法。

图6 贵州省中华蜜蜂不同群体间11个单倍型网络中介图

3 讨论与结论

由贵州省11个自然保护区中华蜜蜂不同群体形态特征聚类分析和主成分分析可知,贵州省自然保护区中华蜜蜂存在一定形态分化,大致分为2个类群,其中,百里杜鹃、草海和宽阔水自然保护区为第一个类群,其余为第二个类群。徐祖荫[23]研究表明:贵州省中华蜜蜂东、西部存在形态遗传分化,西部类群为以威宁(草海)为中心的西北部地区,其类型为云贵高原型;织金—镇宁—册亨一线以东的地区为东部类群,其类型为贵州山地生态型,即华中型;在两者之间的地区为过渡型。匡邦郁等[24]也认为贵州省中华蜜蜂东部和西部种群存在形态分化,类型分别是云贵高原型和华中型。本研究结果与上述学者研究基本相符,但第一类群中宽阔水样点本应与东部类群聚在一起,却与百里杜鹃、草海样点聚在一起,另外位于过渡带地区的水城野钟自然保护区、花溪青岩油杉自然保护区与东部类群聚为一支,说明上述自然保护区中华蜜蜂已受到外界影响,形态发生一定程度的分化。

对贵州省11个自然保护区中华蜜蜂不同群体mtDNA进行分析,单倍型系统发育树表明,11个自然保护区样点中华蜜蜂聚为3个类群。其中,百里杜鹃保护区(H2)、草海保护区(H5)、茂兰保护区(H9)和宽阔水保护区(H10)聚为第一个类群,习水保护区(H7)和清水河保护区(H8)聚为第二个类群,雷公山保护区(H1)、赤水保护区(H3)、佛顶山保护区(H4)和青岩保护区(H11)聚为第三个类群。此前,于瀛龙等[16]、王俊杰[25]的研究表明贵州省中华蜜蜂mtDNA均未发生种群分化。这可能与样本选取、基因片段选择及近年频繁的放蜂引种等因素有关。

贵州省自然保护区中华蜜蜂在形态和mtDNA均存在种群分化。以草海和百里杜鹃保护区为代表的西北部地区分化较明显,其形态及mtDNA均存在明显分化;其次,宽阔水自然保护区、野钟自然保护区、花溪青岩油杉自然保护区受外界影响也发生一定程度的种群分化。造成分化的原因可能与人工引种、放蜂或环境气候变化有关[26]。因此,在未来贵州省自然保护区中华蜜蜂的保护和开发利用中,宽阔水自然保护区、野钟自然保护区、花溪青岩油杉自然保护区种群需给予重视。

不同生境条件会影响蜜蜂种群间的遗传分化[27-28],有研究表明海拔和气候对其影响明显[10-11,29]。草海和百里杜鹃保护区在形态和分子上均聚为一支,同样体现了海拔和气候对蜜蜂种群分化的重要性。草海和百里杜鹃保护区位于云贵高原向湘桂丘陵过渡的斜坡上,其海拔和气候与省内其他地区差距较大。如草海地区平均海拔在2 200 m以上,年均气温仅13～14 ℃。而省内其他地区海拔多在800 m以下,年均气温多在20 ℃以上[23]。另外,在徐祖荫[23]对贵州省中华蜜蜂3个生态群的划分中,每个类群的海拔和气候均有明显的区别。因此,海拔和气候可能是贵州省自然保护区中华蜜蜂发生种群分化的主要原因。

综上,贵州省自然保护区中华蜜蜂已发生一定程度的种群分化,保护贵州省自然保护区中华蜜蜂的自然繁衍已迫在眉睫。因此,要严格执行自然保护区管理条例或法规,按照划定的核心区、缓冲区、试验区实行分级管理[30],确保核心区为中华蜜蜂野生自然状态区,禁止人为干扰,以满足中华蜜蜂自然繁衍;缓冲区为野生向半野生过渡区,可以适当取蜜生产,但不得进行蜂病治疗、人工育王、蜂群引入等;试验区内可对中华蜜蜂进行必要的饲养措施,但需详细记录,在注重保护地方中华蜜蜂资源遗传结构和遗传多样性的条件下充分利用和发展中华蜜蜂[31]。