基于超高压技术的牛骨蛋白绿色提取工艺初探

杨 浩,张 扬,高建萍,康跻耀,孔英俊,张贵锋,张万忠

(1.沈阳化工大学 制药与生物工程学院,沈阳 110142;2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京 100190)

牛骨中含有多种营养物质,其中,牛骨蛋白具有很高的营养价值[1]。牛骨中提取的蛋白具有抗高血压、保护骨健康、抗菌、抗氧化和免疫调节等功效[2],如牛骨胶原肽通过消耗氧自由基,抑制脂质过氧化产物增加[3-4],发挥抗氧化功效。从天然牛骨中提取的具有多种功效的蛋白已广泛应用于食品、医药、化妆品等行业,需求逐年增加,因而牛骨蛋白提取工艺的研究日渐被重视。

目前,以骨为原料的蛋白提取方法主要包括酸法、碱法和酶法[5]。在3种方法的提取过程中,必须首先破坏骨的结构才能提取蛋白。因为在骨结构中,羟基磷灰石以及胶原通过钙交联形成纤维结构[6],该结构致密,需在胶原纤维部分被破坏造成钙流失的条件下,蛋白才可以从骨组织中释放[7]。酸法是采用一定浓度的酸浸泡控温使钙质流失,破坏骨无机成分进行提取,蛋白得率可达2.24%[8],但会对设备产生腐蚀并污染环境[9];碱法是用氢氧化钙溶液控温使胶原明胶化,破坏骨纤维进行提取[10],但与肽键相连的α-氢原子会发生酸碱反应使氨基酸消旋产生有害物质[11],已被酸法和酶法取代。酸法和碱法都面临预处理和提取过程中消耗大量酸或碱、高能耗、污染环境且前处理复杂等问题。酶法是应用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶等酶制剂通过酶切非螺旋区破坏骨纤维之间的交联进行提取,但由于酶切位点的特定性和胶原分子三螺旋结构不易被酶解的特点,提取的蛋白分子量不均匀,不利于吸收[12]。以上3种方法各具优缺点,但骨蛋白提取过程的环境污染问题是三者共性问题,需要进一步改进。

超高压技术(Ultra high pressure,UHP)是利用超过100 MPa的液压,使生物高分子的氢键作用紊乱、立体结构丧失,从而在不影响一级结构的条件下释放活性物质[13]。当前超高压技术在动物源蛋白提取中主要起辅助作用,常用于猪皮、鱼皮等结缔软组织[14-16],需要与其他如pH、酶等条件协同作用,但以骨为原料的超高压提取方法并不多见。李红霞等[17]通过超高压前处理猪骨,木瓜蛋白酶提取,得到少量胶原蛋白及大量游离羟脯氨酸。针对骨组织,超高压技术可以在静力条件下促进骨纤维表面剥落,破坏骨结构从而释放蛋白。同时,超高压提取全程无污染,极大降低了环境污染处理成本。因而,本文以牛骨蛋白提取率为评价标准,通过保压时间、作用压力及环境pH值[18-19]3个影响指标进行响应面分析选取最佳提取条件,研究牛骨蛋白的超高压提取工艺,为新型牛骨蛋白提取工艺研发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

牦牛骨粉购自青海雪牛生物工程有限公司;BCA试剂盒购自北京兰博利德有限公司;其他试剂均为市售分析纯。

1.1.2 仪器与设备

超高压设备UHP购自天津华泰森淼超高压装备工程技术有限公司;酶标仪购自无锡华卫德朗有限公司;凯氏定氮仪购自山东格林凯瑞有限公司;冻干机购自北京松源华兴科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 脱钙方法

用0.72 mol/L的盐酸按照1∶10浸酸料液比室温搅拌8 h充分脱钙[20];完成脱钙后调节pH值至7.0,送入冻干机冻干2 d,得到脱钙骨粉。

1.2.2 蛋白浓度测定

(1)标准溶液配制:取20 mg蛋白标准品(BCA),加入1 mL蛋白标准稀释液,充分溶解,并继续稀释至终浓度为500 μg/mL。

(2)加样:分别设置标准孔、待测样品孔。将500 μg/mL蛋白溶液按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加入96孔板标准孔中,用去离子水补充至20 μL;样品孔中依次加入20 μL待测样品,每个实验组设置3次重复。每孔加入200 μL BCA工作液,37 ℃条件下孵育30 min,酶标板上覆膜,37 ℃温浴1 h。

(3)测定:于562 nm波长测定吸光度值。

(4)计算:各孔吸光度值减去未加500 μg/mL蛋白溶液的吸光度,得到的差值为纵坐标,以蛋白浓度为横坐标,得到标准曲线,根据标准曲线计算得到样品的蛋白浓度。

1.2.3 蛋白提取率计算

提取液中蛋白量占脱钙牛骨粉蛋白量的百分比即为蛋白提取率。

式中,v1为提取液体积,mL;c1为提取液中蛋白质量浓度,mg/mL;m0为原料质量,mg;c0为原料中蛋白量的百分比。

1.2.4 超高压制备工艺

(1)单因素实验条件筛选。

保压时间的影响:称取1 g脱钙骨粉置于密封袋中,分为4个样本,每个样本均加入10 mL去离子水;压力150 MPa,各组样品保压时间分别为10、30、60、90 min。提取完成后,测定提取液蛋白浓度,计算提取率,分析保压时间对提取率的影响趋势。

作用压力的影响:称取1g脱钙骨粉置于密封袋中,分为5个样本,每个样本均加入10 mL去离子水;保压时间为60 min,各组样品作用压力分别为100、125、150、175、200 MPa。提取完成后,测定提取液蛋白浓度,计算提取率,分析作用压力对提取率的影响趋势。

环境pH的影响:称取1g脱钙骨粉置于密封袋中,分为4个样本,每个样本均保持保压时间60 min,作用压力150 MPa;各组样品的环境pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0。提取完成后,测定提取液蛋白浓度,计算提取率,分析环境pH对提取率的影响趋势。

(2)响应面优化实验及参数选择。在单因素实验基础上,将蛋白提取率作为评价指标,应用Design Expert 13软件设计响应面优化实验,确定超高压辅助提取牛骨蛋白的最优工艺条件。因素水平及编码见表1。

表1 响应面实验因素及水平编码值

(3)多次提取实验。按照保压时间60 min、作用压力150 MPa、pH 7.0去离子水进行第1次提取。提取后固体残留烘干,按质量均分为两组a和b,分别依次加入5 mL去离子水和5 mL 0.5%(酶液比)中性蛋白酶水溶液,进行第2次提取。第2次提取后固体残留在同样条件下进行第3次提取。

2 结果与分析

2.1 超高压辅助骨粉提取蛋白的单因素实验

2.1.1 保压时间对骨粉蛋白提取率的影响

作用压力为150 MPa,提取液pH 7.0,保压时间分别为10、30、60和90 min时,各组提取液中蛋白质总量依次为21.093、29.733、30.947和24.733 mg;图1为各组的蛋白提取率,依次为26.4%、37.2%、38.7%和31.2%。由图1可知随着保压时间的增加,蛋白提取率在10～60 min上升,在90 min下降,这与骨粉中骨素析出有关[21]。骨素是骨结构中不可溶的蛋白盐类衍生物[22]。随着保压时间的延长,骨素的析出随之增加,逐渐堵塞骨结构的孔通道,影响后续蛋白的释放,因而蛋白提取率出现先增高后降低的现象。根据实验结果,保压时间选择60 min。

图1 保压时间对蛋白提取率的影响

2.1.2 作用压力对骨粉蛋白提取率的影响

保压时间为60 min,提取液pH 7.0,作用压力分别为100、125、150、175和200 MPa时,各组提取液中蛋白质总量依次为25.613、26.934、30.947、30.013和29.48 mg;图2为各组的蛋白提取率,依次为32%、33.7%、38.7%、37.5%和36.9%。由图2可知蛋白提取率在100～150 MPa升高,在150～300 MPa降低。随着压力升高,骨结构的通道孔径也在扩大,加速了蛋白自骨纤维网络上的脱落;但同时也加速不可溶骨素的析出,一部分水溶性蛋白与溶剂分子之间的斥力会在压力作用下增大,降低溶解性能[23]。当压力超过150 MPa后,出现蛋白提取率降低现象,故作用压力选择150 MPa。

图2 作用压力对蛋白提取率的影响

2.1.3 环境pH对蛋白提取率的影响

保压时间为60 min,作用压力为150 MPa,pH值分别为5.0、6.0、7.0和8.0时,各组提取液中蛋白质总量依次为28.16、30.8、30.947和29.76 mg;图3为各组的蛋白提取率,依次为35.2%、37.6%、38.7%和37.2%。由图3可知,提取率在pH 7.0时达到最高。这可能与牛骨中蛋白溶解性有关。在作用压力150 MPa、保压时间60 min,环境pH 7.0时酸溶性蛋白与碱溶性蛋白有部分被提取,所以该条件下蛋白提取率最高。在酸性环境下酸溶性蛋白提取率增加而碱溶性蛋白提取率随之降低,在碱性条件下碱溶性蛋白提取率增加而酸溶性蛋白提取率降低,故环境pH值选择7.0。

图3 环境pH对蛋白提取率的影响

2.2 响应面实验优化

2.2.1 响应面实验确定最佳超高压辅助提取最佳工艺参数

在单因素实验基础上,使用Design Expert 13软件,根据Box-Behnken中心组合实验设计原理进行响应面优化实验设计,研究保压时间(A)、作用压力(B)和pH(C)共3个因素对牛骨粉蛋白提取率的影响,响应面实验设计与结果见表2。

表2 响应面实验设计与结果

根据实验结果多元回归分析,建立方程:

蛋白提取率=38.7+0.212 5A+0.95B-0.612 5C-0.3AB+0.125AC+0.2BC-3.51A2-4.59B2-5.26C2

响应面实验回归模型方差分析如表3所示。由表3可知超高压辅助提取蛋白回归模型P<0.05,表明该响应面模型显著,可以明确表示牛骨蛋白在超高压下提取与保压时间、作用压力以及pH之间的数量关系规律。模型中B2、C2的P值均小于0.01,差异达到极显著,A2的P=0.012 3≈0.01<0.05,差异不显著,误差较小。经查验R2=0.930 2,表明有93.02%的响应值可以用该模型进行解释,模型适用于本实验理论解释[24-26]。

表3 响应面实验回归模型方差分析

2.2.2 响应面分析

图4直观显示牛骨粉蛋白提取率与各个因素之间的相互关系。等高线的疏密程度用来反映不同因素对牛骨粉蛋白提取率的影响程度,等高线变化越密集,说明该因素对牛骨粉蛋白提取率影响越明显。

(a)保压时间(A)与作用压力(B) ;(b)保压时间(A)与pH(C);(c)作用压力(B)与pH(C)。

由图4(a)可得,当pH(C)因素处于0水平位置,保压时间在30～60 min时,蛋白提取率与保压时间正相关,60 min后,随保压时间增加提取率降低;作用压力在100～150 MPa范围内,蛋白提取率与作用压力正相关,超过150 MPa,蛋白提取率与作用压力成反比关系。保压时间60 min、作用压力为150 MPa时蛋白提取率最高。由图4(b)可得,当作用压力(B)因素处于0水平位置,保压时间在30～90 min时,蛋白提取率先升高再降低;pH值在6～7范围内,蛋白提取率与pH值正相关,pH值超过7时,蛋白提取率与pH值成反比关系。保压时间60 min、环境pH值为7时蛋白提取率最高。由图4(c)可得,当保压时间(A)因素处于0水平位置,作用压力在100～150 MPa范围内,蛋白提取率先升高再降低;环境pH值在6～8范围内,蛋白提取率与pH值先呈正比再呈反比关系。保压时间60 min、pH值为7时蛋白提取率最高。

2.2.3 工艺优化与验证

分析二次回归方程,可得到超高压辅助牛骨粉蛋白提取率最优条件:保压时间为53.777 min,作用压力为188.857 MPa,pH值为6.654,该条件下牛骨粉蛋白的理论提取值为36.058%。对最佳工艺进行实验验证,根据现实工业生产,将预测条件优化为保压时间54 min,作用压力189 MPa,环境pH值6.7。结果得到在该优化条件下,蛋白提取率35.62%,与理论模型预测值吻合度达98.8%,因此,该响应面具有可参考性应用价值。

2.3 多次提取实验结果

多次提取的蛋白提取率结果见表4。结果表明,通过增加提取次数,可以有效地将牛骨中的蛋白进一步释放,提高蛋白提取率,3次提取后提取率可达54.2%。结合中性蛋白酶可以释放一部分难溶蛋白,提高蛋白提取率,最高可达59.3%。

表4 多次提取蛋白提取率

3 结论

本研究以市售牛骨粉为原料,采用超高压辅助pH提取法对骨粉内的蛋白进行提取。根据单因素实验结果选出对蛋白提取率有显著影响的因素(保压时间、作用压力和pH值),进行三因素三水平响应面实验,最终得到超高压辅助pH提取法提取骨粉蛋白最适条件为保压时间54 min,作用压力189 MPa,pH 6.7,在此提取条件下,蛋白提取率可达35.62%。

通过响应面优化方法,建立利用超高压提取牛骨蛋白的方法,筛选最佳牛骨蛋白超高压提取条件,证实超高压技术可以在温和环境下有效提取牛骨蛋白,在pH 7时提取率可达38.7%,经检测牛骨蛋白含量为8.00%,本方法单次提取的得率可达3.10%,将提取次数增加至3次,得率可达4.34%,结合中性酶提取可将得率提升至4.74%。酸法提取牛骨蛋白的得率为2.20%～2.24%,酶法的得率为2.03%～3.32%[8,27-28],本方法的单次得率高于酸法,与酶法得率相当,增加提取次数或结合中性酶法提取可使得率高于现有方法,具有应用推广意义。

超高压提取过程的能耗主要是升压过程中的电力消耗,升压过程不超过1 min,后续保压过程能耗很低,按照厂家提供的处理200 kg的大型设备计算,1 h的提取过程用电不超过10 kW。超高压提取方法的成本主要是设备投资,按设备折旧年限15年计,1吨牛骨蛋白的设备成本为35 178.4元,加上生产消耗的水电等,成本不超过5万元/t,目前牛骨蛋白市场价格为7万元/t,方法具有经济可行性。随着工艺优化、设备改进、生产规模化,超高压提取方法的成本会逐渐降低,而且整个过程无需添加酸或碱,可有效降低污染处理成本,有利于提高经济效益,为牛骨蛋白的绿色提取提供实验依据。