电针调节PI3K/AKT/mTOR 信号通路激活帕金森大鼠脑组织自噬改善行为学反应机制

王飞，李亚楠，张小蕾，胡梦妮，李含章，马骏*

1.武汉市第一医院中医部，武汉 430022； 2.湖北中医药大学针灸骨伤学院，武汉 430022

帕金森病是中枢神经系统退行性疾病，多发于老年人，近年来该疾病趋于年轻化，成为影响中老年人健康的主要疾病之一[1]。深部脑刺激（deep brain stimulation，DBS）手术可以改善晚期帕金森患者的运动症状和生活质量[2]。然而，该手术仅用于药物不能充分控制症状的患者，大多数患者术后仍需服药。因此，亟需开发特异性的治疗手段、辅助药物。已知多条通路参与调控该疾病，磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶 B（protein kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路的激活参与调控神经细胞的多个生理活动，如抑制细胞死亡、缓解细胞自噬等[3]。该通路可加速神经细胞增殖和分化，过度激活则会导致神经信号传递异常，造成中枢神经系统损伤，引发阿尔兹海默症[4]。通过调控该通路，抑制通路蛋白表达和激活，可显著促进细胞自噬反应，提升酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase，TH）含量，降解多余α-突触核蛋白（αsynuclein，α-syn），从而保护神经元，缓解帕金森病[5]。针灸作为传统中医学的重要治疗手段，可延缓神经递质传递，缓解神经疼痛，广泛应用于神经疼痛治疗，对于神经系统疾病具有良好的治疗效果，越来越成为医学界研究的热点[6,7]。针灸对于帕金森病具有良好疗效，但作用机理有待明确[8]。本研究构建帕金森大鼠模型，探究电针治疗通过调控PI3K/AKT/mTOR 信号通路影响帕金森大鼠脑组织的自噬和行为学反应作用机制，为帕金森病的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1 主要试剂与仪器 鱼藤酮（货号ST80190120）购于诗丹德（上海）标准技术服务有限公司，西罗莫司（批准文号H20130698）购于辉瑞爱尔兰药品公司，线粒体提取试剂盒（货号MP-007）购于英文特生物技术有限公司，柠檬酸抗原修复液（货号SJH0712）购于如吉生物（上海）科技有限公司，H2O2（货号H112520）购于aladdin 公司，兔抗鼠GAPDH 抗体（货号ab9485）、兔抗鼠TH 抗体（货号ab137869）、兔抗鼠α-syn 抗体（货号ab212184）、兔抗鼠PI3K 抗体（货号ab133595）、兔抗鼠AKT 抗体（货号ab38449）、兔抗鼠mTOR 抗体（货 号ab134903）、兔 抗 鼠p-PI3K 抗 体（货 号ab207484）、兔抗鼠p-mTOR 抗体（货号ab109268）、兔抗鼠微管相关蛋白1 轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）B-II/LC3B-I 抗体（货号ab63817）、兔抗鼠Beclin1 抗体（货号ab207612）购于Abcam 公司，兔抗鼠p-AKT 抗体（货号9271T）购于CST 公司，电针治疗仪（6805-A，武汉科尔达医疗科技有限公司），线粒体呼吸检测仪（Oxytherm，汉莎科学仪器有限公司），荧光定量PCR 仪（7500，ABI 公司），凝胶成像系统（CA-268，上海精密仪器仪表有限公司）。

1.1.2 实验动物及建模 由华中科技大学动物实验中心购得清洁级SD 大鼠60 只，6 周龄，体质量（200±25）g，SCXK（鄂）2021-0009。麻醉所有大鼠，配置鱼藤酮溶液（2 g/L，葵花油溶解）[9]，随机选取48 只于颈背部皮下注射鱼藤酮溶液1 mL，余12 只作为对照组注射等剂量葵花油，每日1 次，连续注射4 周。末次注射12 h 后，观察大鼠行动能力，行动偏向一侧、身体持续震颤、动作迟缓且活动能力较弱判定为构模成功。将帕金森大鼠模型分为帕金森组、电针组、西罗莫司组、电针+PI3K 激活组，每组12 只。电针组、电针+PI3K 激活组大鼠选取穴位“太冲”、“风府”进行电针治疗，选用0.5 寸毫针，针灸深约5 mm，接通正负极，电流强度1 mA，持续通电15 min，1 次/日；西罗莫司组大鼠腹腔注射西罗莫司1 mg/kg；电针+PI3K 激活组腹腔注射PI3K 激活剂Recilisib 5 mg/kg；对照组、帕金森组、电针组大鼠腹腔注射等剂量生理盐水。持续处理14 d。

1.2 研究方法

1.2.1 动物行为学评定 各组大鼠末次治疗12 h 后通过斜板实验和旷场实验进行行为学评定。斜板实验：准备一块平整的木板，木板上放置橡胶垫（厚约0.5 cm），依次将大鼠置于橡胶垫中心位置，确保大鼠不抓挠依附木板边缘，将木板倾斜角缓慢提升至30°，随后逐渐增大倾斜角，如果大鼠能在木板上停留5 s以上，则再次提升角度，直至大鼠停留时间短于5 s，记录此刻的斜板角度，每只大鼠连续重复3 次，取平均值作为斜板停留最大角度。旷场实验：利用特制的旷场分析箱进行试验，箱底部区域为横五排竖五排的方格，每个方格大小25 cm×25 cm。将大鼠放置于箱底中央格子中，记录3 min 内大鼠跨越格子数（3 爪以上跨入即算）和站立次数（前肢离地1 cm 以上）[10]。

1.2.2 脑组织线粒体活性检测 各组随机选取6 只大鼠，麻醉后迅速处死，剖开脑部，分离脑组织，匀浆器打磨至匀浆状态，按照线粒体提取试剂盒说明书提取线粒体，线粒体呼吸检测仪检测state3、state4 呼吸速率，计算线粒体呼吸控制比（mitochondrial respiration controlling rate，RCR），RCR=state3 呼吸速率/state4 呼吸速率×100%。采用荧光素酶标记法检测ATP 合成酶活性，配置反应体系，ADP 激活反应，记录发光强度，确定ATP 合成量。

1.2.3 免疫组化检测脑黑质TH、α-syn 蛋白表达 各组剩余6 只大鼠麻醉后迅速处死，剥离脑组织分离黑质区，部分切下经液氮处理后研磨至粉冻存备用，部分置于4%多聚甲醛中固定。固定24 h 后，常规脱水包埋制作石蜡切片，脱蜡至水，柠檬酸抗原修复液加热处理修复组织抗原，滴加H2O2室温孵育5 min，PBS清洗3 次，山羊血清封闭液封闭10 min，滴加一抗（TH抗体、α-syn 抗体，1：200），4 ℃孵育过夜，PBS 清洗3次，滴加生物素标记的羊抗兔二抗，室温孵育15 min，PBS 清洗3 次，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育15 min，PBS 清洗3 次，滴加DAB 溶液，完全显色后清水洗净，苏木素染色复染，PBS 清洗直至返蓝，酒精梯度脱水后封片置于显微镜下观察。

1.2.4 Western blot 检 测 自 噬 及PI3K/AKT/mTOR 通 路相关蛋白表达及磷酸化 取出1.2.3 中冻存的脑组织粉末，滴加蛋白裂解液后充分混合，使蛋白充分裂解提取总蛋白，按照试剂盒说明书检测提取蛋白质量，取定量与上样缓冲溶液混合加热变性，加入凝胶孔道中，进行电泳跑胶，转膜后脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗（GAPDH 抗体、PI3K 抗体、p-PI3K 抗体、AKT 抗体、p-AKT 抗体、mTOR 抗体、p-mTOR 抗体、LC3B 抗体、Beclin1 抗体，1：1000），4 ℃孵育过夜。TBST 清洗3次，加入羊抗兔二抗（1：800），室温孵育45 min，TBST清洗3 次，将发光试剂A 液和B 液混合均匀，倒于膜上，静置1 min 后吸干多余水分，利用光密度扫描系统（Syngene）分析条带灰度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 电针治疗对帕金森大鼠行为学反应影响

斜板停留最大角度、跨格次数、站立次数统计，与对照组相比，帕金森组大鼠显著降低（P＜0.05）；与帕金森组相比，电针组、西罗莫司组大鼠显著升高（P＜0.05）；与电针组相比，电针+PI3K 激活组大鼠显著降低（P＜0.05）；西罗莫司组与电针组相比无统计学差异（P＞0.05），见图1。

图1 各组大鼠斜板停留最大角度（A）、跨格次数（B）、站立次数（C）统计图* P＜0.05，与对照组相比 #P＜0.05，与帕金森组相比 ※P＜0.05，与电针组相比n=12Fig.1 Comparison of maximum angle of sloping plate stay (A), times of crossing lattice (B), and times of standing (C) of rats in each group Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=12

2.2 电针治疗对帕金森大鼠脑组织病理学影响

大鼠脑组织RCR、ATP 合成酶活性、黑质内TH 平均光密度检测，与对照组相比，帕金森组大鼠显著降低，α-syn 平均光密度显著升高（P＜0.05）；与帕金森组相比，电针组、西罗莫司组大鼠显著升高，α-syn 平均光密度显著降低（P＜0.05）；与电针组相比，电针+PI3K激活组大鼠显著降低，α-syn 平均光密度显著升高（P＜0.05）；西罗莫司组与电针组大鼠相比无显著差异（P＞0.05），见图2～3。

图2 各组大鼠脑组织RCR、ATP 合成酶活性统计图* P＜0.05，与对照组相比 #P＜0.05，与帕金森组相比 ※P＜0.05，与电针组相比n=6Fig.2 Comparison of RCR and ATP synthase activity in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=6

图3 各组大鼠黑质TH、α-syn 表达A：TH 免疫组化染色结果B：TH 平均光密度统计图C：α-syn 免疫组化染色结果D：α-syn 平均光密度统计图*P＜0.05，与对照组相比 #P＜0.05，与帕金森组相比 ※P＜0.05，与电针组相比n=6Fig.3 Expression of TH and α-syn in substantia nigra of rats in each group A: Results of TH immunohistochemical staining; B: Statistical diagram of TH average optical density value; C: Results of α-syn immunohistochemical staining; D: Statistical diagram of average optical density values of α-syn Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=6

2.3 电针治疗对帕金森大鼠脑组织自噬反应影响

大鼠脑组织Beclin1 蛋白表达量、LC3B-II/LC3B-I检测，与对照组相比，帕金森组大鼠显著升高（P＜0.05）；与帕金森组相比，电针组、西罗莫司组大鼠显著升高（P＜0.05）；与电针组相比，电针+PI3K 激活组大鼠显著降低（P＜0.05）；西罗莫司组与电针组大鼠相比无显著差异（P＞0.05），见图4。

图4 各组大鼠脑组织LC3B-I、LC3B-II、Beclin1 蛋白表达量*P＜0.05，与对照组相比 #P＜0.05，与帕金森组相比 ※P＜0.05，与电针组相比n=6Fig.4 Protein expressions of LC3B-I, LC3B-II and Beclin1 in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=6

2.4 电针治疗对帕金森大鼠脑组织PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白磷酸化影响

大鼠脑组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR 值检测，与对照组相比，帕金森组大鼠显著升高（P＜0.05）；与帕金森组相比，电针组、西罗莫司组大鼠显著降低（P＜0.05）；与电针组相比，电针+PI3K 激活组大鼠显著升高（P＜0.05）；西罗莫司组与电针组大鼠相比无显著差异（P＞0.05），见图5。

图5 各组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR 蛋白表达量*P＜0.05，与对照组相比 #P＜0.05，与帕金森组相比 ※P＜0.05，与电针组相比n=6Fig.5 Protein expressions of PI3K,AKT, mTOR, p-PI3K, p-AKT and p-mTOR in brain tissue of rats in each group Compared with control group, *P＜0.05; Compared with Parkinson group, #P＜0.05; Compared with electropuncture group, ※P＜0.05 n=6

3 讨论

帕金森病的发作受遗传和多种环境因素影响，患者脑组织内线粒体代谢异常，细胞自噬不足，导致αsyn 大量积累，破坏神经功能，使患者产生强烈的震颤，造成肌强直，严重者肢体扭曲，生活不能自理[11]。了解帕金森病的发展机制、寻找有效的治疗措施至关重要。检测行为学功能是评估该病的重要指标。本研究应用斜板实验和旷场实验验证大鼠模型构建成功，帕金森大鼠产生行为学障碍，斜板停留最大角度、跨格次数、站立次数显著降低，具有帕金森病的典型症状[12]。

电针治疗为常见中医药治疗手段，在缓解疼痛方面具有良好的疗效，专家推测其对于帕金森病具有一定的治疗效果[13]。研究发现，电针治疗可缓解帕金森大鼠的神经功能障碍，改善大鼠的认知功能[14]。药物配合电针治疗被临床验证具有良好的效果[15]。但电针治疗的作用机理有待进一步明确。本研究选用对于帕金森具有良好缓解效果的西罗莫司作为阳性对照[16]，结果发现电针治疗和西罗莫司处理后，大鼠的斜板停留最大角度、跨格次数、站立次数显著升高，表明电针治疗后帕金森大鼠的行为学功能得到改善，但作用途径有待明确。

帕金森是由脑组织线粒体活性异常，引发ATP 合成受阻，自噬活性降低，TH 含量减低，造成α-syn 蛋白沉积，导致神经元受损[17]。通过该途径相关指标发现，帕金森大鼠脑组织内RCR、ATP 合成酶活性、TH含量显著降低，α-syn、Beclin1 蛋白表达量、LC3B-II/LC3B-I 显著升高，与既往研究一致。电针治疗和西罗莫司处理后，RCR、ATP 合成酶活性、TH 含量、Beclin1 蛋白表达量、LC3B-II/LC3B-I 显著升高，α-syn蛋白表达量显著降低，表明电针治疗可显著改善脑组织线粒体活性，激活自噬，提高TH 表达，加速降解αsyn，从而缓解帕金森，但作用机理有待进一步明确。

PI3K/AKT/mTOR 信号通路激活可加速细胞因子生长，抑制自噬，是常见的自噬调控通路。川芎嗪可通过抑制该通路相关蛋白激活，从而加速自噬，缓解糖尿病大鼠的肾损伤[18]。PI3K/AKT/mTOR 信号通路在帕金森病中同样发挥作用。姜黄素可通过调控PI3K/AKT/mTOR 信号通路，激活自噬的同时改善帕金森病[19]。研究发现，电针治疗可抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路相关蛋白激活，缓解骨骼肌萎缩大鼠的神经损伤[20]，推测电针治疗影响帕金森大鼠病情与调控PI3K/AKT/mTOR 信号通路有关。本研究发现，帕金森组大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度显著升高，电针治疗和西罗莫司处理后，大鼠脑组织PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度显著降低，证实电针治疗很可能通过调控PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化影响帕金森病情。为进一步验证，本实验在电针治疗的同时激活PI3K，结果发现PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化程度显著升高，同时大鼠脑组织内RCR、ATP 合成酶活性、TH 含量、Beclin1 蛋白表达量、LC3B-II/LC3B-I 显著降低，α-syn 蛋白表达量显著升高，斜板停留最大角度、跨格次数、站立次数显著降低，进一步验证相关假设。

综上所述，电针治疗可通过抑制PI3K、AKT、mTOR 蛋白磷酸化，增强线粒体活性，增加TH 含量，激活脑组织自噬，缓解α-syn 蛋白沉积，从而改善帕金森大鼠运动行为功能。但电针治疗是否通过其他通路间接参与调控帕金森病，还有待进一步实验加以明确。