西罗莫司通过MAPK信号通路抑制人宫颈癌细胞增殖的实验研究

贾利刚，褚兆苹，田 菲，韩 华，代聪伟，王 蓓，张 媛

(河北省人民医院妇科,石家庄 050051)

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤，虽然近年来随着宫颈细胞学筛查技术的不断提高，发病率及病死率有所降低，但患者呈年轻化趋势[1-3]。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族是一类与细胞增殖、凋亡、分化、应激反应等密切相关的丝氨酸/苏氨酸激酶，主要包括细胞外信号调节激酶(ERK)，p38 MAPK，c-Jun氨基末端激酶(JNK)3个亚族[4-6]。研究显示MAPK信号通路在众多实体肿瘤中被高度激活，抑制此信号通路的活化成为多种抗肿瘤药物的靶点之一[4-6]。西罗莫司是从复活岛上发现的一种大环内酯类抗生素，动物药理实验发现西罗莫司是一种低毒、高效、无肾毒性的新型免疫性抑制剂，被广泛地应用于肾移植中[7-8]。另外研究还显示西罗莫司能够通过抑制其靶蛋白mTOR表达进而调控下游基因转录，发挥对卵巢癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、宫颈癌等肿瘤细胞的杀伤作用[9-13]，而西罗莫司是否能够通过抑制MAPK信号通路进而发挥其抗肿瘤作用尚未见报道，因此本研究将旨在探讨西罗莫司能否通过MAPK信号通路抑制宫颈癌Hela细胞的增殖。

1 材料与方法

1.1细胞株 宫颈癌细胞Hela购自中国科学院细胞库，培养于含有15%胎牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃，5% CO2条件下培养。

1.2试剂与仪器 DMEM培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Cyclin D1、p21、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 MAPK、p-p38 MAPK及GAPDH多克隆抗体均购于美国Abcam公司；Annexin V-FITC/PI流式双染试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒，细胞周期检测试剂盒、SB203580(ERK1/2抑制剂)、SP600125(JNK抑制剂)、PD98059(p38 MAPK抑制剂)均购于南通碧云天生物技术有限公司。ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司；MK3酶标仪购自美国Thermo公司。

1.3细胞分组 (1)将0、10、30、100 nmol/L的西罗莫司作用于Hela细胞，为0、10、30、100 nmol/L组；(2)将细胞分为正常对照组(无任何药物处理)，西罗莫司组(30 nmol/L西罗莫司)，西罗莫司+SB203580组(30 nmol/L西罗莫司+10 μmol/L SB203580)，西罗莫司+SP600125(30 nmol/L西罗莫司+10 μmol/L SP600125)，西罗莫司+PD98059(30 nmol/L西罗莫司+10 μmol/L PD98059)。

1.4四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测Hela细胞活力 将5×103个Hela细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按“1.3(1)”分组，并将细胞培养24、48、72 h，加入MTT孵育4 h后再加入150 μL的二甲基亚砜，震荡使结晶物溶解，测定吸光度(A)。

1.5Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡 将9×103个Hela细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按“1.3(1)”分组，并将细胞培养48 h，收集细胞，加入结合缓冲液混匀后，继续加入Annexin V-FITC及PI并混匀，1 h内上流式细胞仪进行细胞凋亡的检测并分析。

1.6流式细胞术检测细胞周期 将9×103个Hela细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按“1.3(1)”分组，并将细胞培养48 h，收集细胞，加入核糖核酸酶(RNase)混匀并孵育1 h，再加入PI染液孵育30 min，1 h内上流式细胞仪进行细胞周期的检测并分析。

1.7Western blot 将9×103个Hela细胞接种到6孔板，待细胞贴壁后，按“1.3(2)”分组，并将细胞培养48 h，收集细胞并裂解得到细胞总蛋白，测定蛋白浓度。制作浓缩胶和分离胶，蛋白上样后，进行凝胶电泳，湿法转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，于凝胶成像系统中曝光。

2 结 果

2.1西罗莫司对Hela细胞活力的影响 0、10、30、100 nmol/L西罗莫司作用Hela细胞24、48、72 h，西罗莫司呈时间及浓度依赖性地降低细胞活力(P<0.01)，见表1。

表1 西罗莫司对Hela细胞活力的影响

2.2西罗莫司对Hela细胞凋亡及细胞周期的影响 0、10、30、100 nmol/L西罗莫司作用Hela细胞48 h，经流式细胞术发现，与0 nmol/L组比较，10、30、100 nmol/L组细胞早期凋亡率及晚期凋亡率均显著提高(均P<0.05)，并使细胞周期阻滞在G1期(均P<0.01)，见表2。

表2 西罗莫司对Hela细胞凋亡及细胞周期的影响

a:P<0.01，与同时间点0 nmol/L组比较

2.3西罗莫司对Hela细胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及p21表达的影响 0、10、30、100 nmol/L的西罗莫司作用Hela细胞48 h，与0 nmol/L组比较，10、30、100 nmol/L组细胞中Cyclin D1、Bcl-2相对表达水平下调(P<0.01)，Bax及p21的相对表达水平上调(P<0.01)。见表3。

表3 西罗莫司对Hela细胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及p21表达的影响

a:P<0.01，与0 nmol/L组比较

2.4西罗莫司对Hela细胞中ERK1/2、JNK及p38 MAPK磷酸化水平的影响 0、10、30、100 nmol/L的西罗莫司作用Hela细胞48 h，与0 nmol/L组比较，10、30、100 nmol/L组细胞中p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK相对表达水平下调(P<0.01)，见表4。

2.5阻断ERK1/2、JNK及p38 MAPK信号通路对西罗莫司处理的Hela细胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及p21表达的影响 与西罗莫司组比较，西罗莫司+SB203580组、西罗莫司+SP600125、西罗莫司+PD98059组细胞中Bax及p21相对表达水平上调(P<0.01)，Bcl-2及Cyclin D1相对表达水平下调(P<0.01)。见表5。

表4 西罗莫司对Hela细胞中ERK1/2及p38 MAPK磷酸化水平的影响

a:P<0.01，与0 nmol/L组比较

2.6阻断ERK1/2、JNK及p38 MAPK信号通路对西罗莫司处理的Hela细胞中MAPK信号通路相关蛋白表达的影响 与西罗莫司组比较，西罗莫司+SB203580组、西罗莫司+SP600125、西罗莫司+PD98059组细胞中p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK相对表达水平下调(P<0.01)。见表6。

表5 阻断ERK1/2、JNK及p38 MAPK信号通路对西罗莫司处理的Hela细胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1及p21表达的影响

a:P<0.01，与正常对照组比较;b:P<0.01，与西罗莫司组比较

表6 阻断ERK1/2、JNK及p38 MAPK信号通路对西罗莫司处理的Hela细胞中MAPK信号通路相关蛋白的影响

a:P<0.01，与正常对照组比较;b:P<0.01，与西罗莫司组比较

3 讨 论

西罗莫司是1964年从复活岛上发现的一种新型抗生素，接着研究者还发现西罗莫司具有抗酵母菌感染作用，提示西罗莫司的免疫抑制作用[7-8]。后续众多学者发现西罗莫司还具有显著的抗肿瘤作用[9-12]。本课题组前期已经证实西罗莫司能显著抑制Hela细胞侵袭、转移[13]，但西罗莫司对Hela细胞增殖的影响及相关机制尚报道较少。所以本研究首先采用MTT法检测不同浓度的西罗莫司对Hela细胞活力的影响，结果表明西罗莫司能显著降低Hela细胞活力，并呈时间及浓度依赖性。接着采用流式细胞术检测西罗莫司对Hela细胞凋亡及细胞周期的影响，结果表明西罗莫司能显著提高细胞凋亡率，并使细胞周期阻滞于G1期。

细胞的凋亡受细胞凋亡相关蛋白调控，Bcl-2家族中的抑制凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax结合，阻断上游凋亡信号传递，促进细胞存活与生长。而促凋亡蛋白Bax自身还能够形成二聚体，传递上游凋亡信号，最终诱导细胞凋亡。细胞周期和细胞凋亡密不可分，细胞周期由细胞周期相关蛋白调控，与G1期最为密切相关的周期蛋白Cyclin D1与细胞周期依赖性蛋白激酶4/6(CDK4/6)结合形成复合物，促使Rb磷酸化，诱导核转录因子E2F3进入细胞核促进增殖相关基因转录，而细胞周期蛋白抑制子p21通过抑制细胞周期蛋白与CDK4/6的结合，进而阻断细胞的恶性增殖[14-15]。已经有研究显示西罗莫司能够通过上调Bax及p21表达，下调Bcl-2及Cyclin D1表达，使细胞周期阻滞于G1期[9,11-12]，推测西罗莫司可能能够通过调控细胞周期相关蛋白表达使Hela细胞周期发生阻滞。本研究结果正如推测所示，西罗莫司能显著下调Bcl-2及Cyclin D1表达，上调Bax及p21表达，继而使细胞周期阻滞于G1期，并诱导细胞凋亡。

MAPK家族成员主要包括ERK、JNK及p38 MAPK等，此家族介导的信号通路与细胞的增殖、凋亡、分化、细胞骨架重排、细胞应激行为密切相关。其中ERK共有7个亚族，ERK1及ERK2是最为重要的两个亚族，受上游信号激活后，转移到细胞核内，使下游转录因子磷酸化，同时部分蛋白留在细胞质中，共同介导细胞凋亡、增殖、细胞骨架重排等生物学行为。JNK共有3个亚族，分别为JNK1、JNK2及JNK3，此信号通路被激活能够激活p38 MAPK信号通路，共同介导细胞的增殖与应激行为。研究显示MAPK信号通路在宫颈癌的发生发展中被高度激活，并成为包括宫颈癌在内多种肿瘤的治疗靶点[4-6]。另外也有多个研究显示西罗莫司对MAPK信号通路具有显著的调控作用[16-18]。因此本研究进一步探讨西罗莫司对Hela细胞中MAPK信号通路的影响，结果表明西罗莫司能显著的下调p-ERK1/2、p-JNK、p-p38 MAPK表达。

同时为了进一步证实西罗莫司确实是通过此信号通路抑制Hela细胞增殖，本研究还选用ERK1/2抑制剂SB203580，JNK抑制剂SP600125，p38 MAPK抑制剂PD98059分别与西罗莫司共同作用Hela细胞48 h，采用Western blot检测西罗莫司联合抑制剂对Hela细胞中Bax、Bcl-2、Cyclin D1、p21、p-ERK1/2、p-JNK及p-p38 MAPK表达的影响，结果表明与西罗莫司组比较，西罗莫司联合抑制剂组(SB203580、SP600125、PD98059)能显著的下调Bcl-2，Cyclin D1表达，上调Bax及p21表达，并降低ERK1/2、JNK及p38 MAPK磷酸化水平，从而说明说明西罗莫司对Hela细胞的增殖抑制作用确实是通过阻断MAPK信号通路实现的。

综上所述，10、30、100 nmol/L的西罗莫司能显著的降低Hela细胞活力，诱导细胞凋亡，使细胞周期阻滞于G1期，下调Bcl-2，Cyclin D1表达，上调Bax及p21表达，此过程是通过阻断MAPK信号通路实现的。