消炎止痛膏对脂多糖诱导的C2C12 分化肌管影响

钟伟兴，谌祖江，李俊桦，邝珊珊，王宁，张璇，李义凯，*

1.南方医科大学中医药学院，广州 510515； 2.南方医科大学第三附属医院，广州 510630

骨骼肌急性钝挫伤（acute skeletal muscle blunt trauma）指骨骼肌因外界突然直接的暴力作用造成肌纤维损害，出现局部肿胀瘀血，肌纤维断裂，肌细胞溶解崩塌等，从而导致骨骼肌功能和结构的不可逆损害。由于骨骼肌损伤及修复机制极其复杂，国内外学者对其进行了大量的研究，尚未得到统一观点和意见[1,2]。膏摩疗法（ointment massage therapy）[3]是将中药外用膏药与按摩手法相结合的治疗方法，是中医外治法的重要组成部分。本团队从事膏摩疗法对急慢性软组织疼痛的机制研究和临床研究，本实验在临床研究和动物实验基础上开展体外细胞实验，观察消炎止痛膏成分对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的C2C12 骨骼肌细胞炎症模型的影响，包括炎症反应和氧化应激状态，探讨膏摩疗法的膏药成分对骨骼肌钝挫伤的疗效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 C2C12 细胞系购自中国科学院昆明细胞所，培养于含DMEM/F12 培养基（含10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素溶液）的培养瓶，置于37 ℃，体积分数5% CO2孵箱中，隔天换液，观察细胞形态和生长情况。

1.2 主要试剂 双氯芬酸钠（diclofenac sodium）购自ACMEC 公 司，DMEM/F12 培 养 基 购 自 美 国Gibco 公司，马血清购自美国Hyclone 公司，胎牛血清购自Biological Industries，胰酶细胞消化液（含0.25%胰酶、0.02% EDTA 和酚红）和青霉素-链霉素溶液购自Beyotime 公司，LPS 购自Solarbio 公司，小鼠IL-1β 和IL-6 的ELISA 检测试剂盒购自Multisciences 公司。CCK-8 试剂盒购自Fdbio science 公司，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试 剂 盒 和 丙 二 醛（malondialdehyde, MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究有限公司。

1.3 主要仪器与软件 正置白光拍照显微镜（日本Nikon），酶标检测仪（美国BioTek），台式高速冷冻离心机（中国Dragon），Image-Pro Plus 6.0（美国Media Cybemetics）等。

1.2 实验方法

1.2.1 C2C12 诱导分化模型建立 用胰酶消化增殖培养至80%～90%融合的C2C12 细胞，更换为分化培养基（含2%马血清），置于37 ℃，体积分数5% CO2孵箱中培养，每天更换分化培养基，观察细胞形态和生长情况，直至出现肌管，并确定最佳分化时间。

1.2.2 实验分组 C2C12 细胞诱导分化完全后，设置空白组、模型组、双氯芬酸钠（阳性对照药物）组、消炎止痛膏组进行实验。消炎止痛膏组将中药血竭、冰片、乳香、没药、红花、儿茶各称取10 g，放置于洁净煎药锅中，加双蒸水至没过药材1 横指，浸泡30 min；武火煎煮，沸腾后继续煎煮30 min；将熬制好的药液倒入洁净的烧杯中，再向煎药锅加入适量双蒸水，武火煎煮30 min；将两次熬出的药液混合，用200 目筛过滤2 次后置入坩埚；用水浴锅蒸发直至变为糊状药物，转移至无菌培养皿，用保鲜膜覆盖并戳出数孔，放置-80 ℃冰箱中冷冻24 h；将冷冻好的药液置于真空冷冻干燥机干燥；收集冻干粉，-80 ℃密闭保存备用。以上步骤在南方医科大学中药药理实验室完成。冻干粉称重，用含DMEM/F12 的完全培养基配成10 mg/mL 溶液，4 ℃保存。实验时将溶液稀释成需要的浓度，现用现配。

双氯芬酸钠组将购置的双氯芬酸钠粉剂用含DMEM/F12 的完全培养基配成1000 μg/mL 溶液，4 ℃保存。实验时将溶液稀释成需要的浓度，现用现配。

1.2.3 LPS 介导C2C12 细胞炎症模型建立 根据诱导分化模型结果，用96 孔板分化培养C2C12 细胞，加入LPS 溶液并分为低、中、高浓度组（0.1、1、10 μg/mL），分别作用30 min、3 h、12 h、24 h 后用CCK-8 法测定各组细胞活性，用IL-6 ELISA 试剂盒检测各组各时间点IL-6 浓度，以确定LPS 致炎的最佳浓度及作用时间。

1.2.4 筛选药物对C2C12 细胞炎症模型最佳干预浓度 设立双氯芬酸钠（阳性对照药物）组和消炎止痛膏组干预LPS 介导的C2C12 细胞炎症模型。双氯芬酸钠浓度梯度为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL，消炎止痛膏浓度梯度50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125 mg/mL，分别作用24 h，CCK-8 测定各组细胞活性，IL-6 ELISA 试剂盒检测各组IL-6 浓度，确定双氯芬酸钠和消炎止痛膏的最佳干预浓度。

1.2.5 CCK-8 测定细胞活性 调整C2C12 细胞浓度为1×104/mL，在96 孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），将孔板放置于培养箱（37 ℃，5% CO2）培养至贴壁后给予干预措施。每孔加入CCK-8 溶液10 μL，并重新将孔板放置培养箱中孵育2 h、4 h，分别用酶标仪测定450 nm 处的OD 值。根据CCK-8 说明书计算细胞存活率。

1.2.6 ELISA 试剂盒检测IL-1β、IL-6 含量 从孔板中吸出各组细胞培养基，3000 r/min 离心10 min，收集上清，即刻检测。采用100 μL 反应体系，每组设置3 个复孔，具体操作按Multisciences 公司试剂盒说明书进行。最后使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm 参考波长的OD 值。校准后的OD 值为450 nm 的测定值减去630 nm 的测定值。

1.2.7 检测SOD、MDA 含量 从孔板中吸出各组细胞培养基，3500 r/min 离心10 min，收集上清进行SOD、MDA 测定。取出96 孔板，按照说明书加入标准孔、空白孔、测定孔、对照孔相应试剂及样品，涡旋混匀器混匀，95 ℃水浴30 min，取出冷却，3500 r/min离心10 min，取上清，于相应波长处，用酶标仪测定各管吸光度，并根据公式：血清MDA 含量（nmol/mL）=（测定OD-对照OD）/（标准OD-空白OD）×标准品浓度（10 nmol/mL）×样本测试前稀释倍数，计算出对应含量。

1.3 统计分析

采用IBM SPSS 22.0 版软件进行统计学分析，Graph Pad Prism 8 制图软件制图，计量资料以均数±标准差（）表示，符合正态分布且方差齐用One-Way ANOVA 检验，各组间比较采用LSD 检验，非正态分布用非参数检验（Mann-Whitney U 检验、Wilcoxon 符号秩和检验、Kruskal-Wallis H 检验）；计数资料以频数表示，比较采用Chi-square 检验，检验水准α=0.05，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 C2C12 细胞增殖与分化培养

C2C12 在含10%胎牛血清的DMEM/F12 培养基中培养，开始时细胞稀疏形态呈梭形；增殖过程中，细胞密度增大，形态变长变细，呈纤维状，4～5 d 后细胞基本增殖完全，未见肌管出现（图1）。

图1 增殖培养6、12、24 及96 h 的C2C12 细胞形态（标尺100 μm）Fig.1 Morphology of C2C12 cells cultured for 6h, 12h, 24h and 96h (bar=100 μm)

C2C12 细胞在含2%马血清的DMEM/F12 培养基中培养，4～5 d 后显微镜下观察到细胞变大变长出现融合，融合渐多，形成许多有两个以上似串珠样细胞核的肌管，分化培养至第9～10 d 达高峰（图2），之后细胞逐渐衰老死亡，细胞成片脱落[4]。

图2 分化培养1、5、8 及10 d 的C2C12 细胞形态（标尺100 μm）Fig.2 Morphology of C2C12 cells differentiated and cultured for 1d, 5d, 8d and 10d (bar=100 μm)

2.2 LPS 作用C2C12 肌管细胞最佳炎症模型

运用CCK-8 和IL-6 ELISA 试剂盒分别检测0.1、1、10 μg/mL 的LPS 刺激C2C12 肌管细胞30 min、3 h、12 h、24 h，0.1 μg/mL 作用30 min 细胞活性无明显改变（P＞0.05）；1 μg/mL LPS 作用C2C12 肌管细胞24 h炎性细胞因子IL-6 水平最高（图3）。因此，LPS 刺激C2C12 肌管细胞的最佳时间为24 h，最佳浓度为1 μg/mL。

2.3 药物干预最佳浓度

CCK-8 实验结果表明，与模型组比较，浓度低于1.25 mg/mL 的消炎止痛膏组细胞活性无明显变化（P＞0.05），5 mg/mL 和2.5 mg/mL 消炎止痛膏组细胞活性明显下降（P=0.005，P=0.002），因此浓度低于1.25 mg/mL 的消炎止痛膏较为安全；IL-6 ELISA 实验结果表明，安全浓度1.25 mg/mL 消炎止痛膏组的IL-6 浓度最低（P=0.001）（图4A）。

图4 不同浓度消炎止痛膏溶液（A）和双氯芬酸钠溶液（B）作用C2C12 肌管炎症模型24 h 细胞活性和IL-6 表达情况Fig.4 Cell activity and IL-6 expression of C2C12 myofibers inflammation model treated with Xiaoyanzhitong Ointment solution and diclofenac sodium solution at different concentrations for 24h.A: 5.0 mg/ml, 2.5 mg/ml, 1.25 mg/ml, 0.625 mg/ml, 0.3125 mg/ml, 0.15625 mg/ml, 0.078125 mg/ml Xiaoyanzhitong Ointment solution solution; B: 200 μg/ml, 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml, 12.5 μg/ml, 6.25 μg/ml, 3.125 μg/ml diclofenac sodium solution

CCK-8 实验结果表明，与模型组比较，3.125～200 μg/mL 双氯芬酸钠组细胞活性无明显变化（P＞0.05）；IL-6 ELISA 实验结果表明，6.25 μg/mL 双氯芬酸钠组的IL-6 浓度最低（P=0.077）（图4B）。

2.4 消炎止痛膏对C2C12 肌管影响

与模型组比较，1.25 mg/mL 消炎止痛膏显著抑制LPS 诱 导 的C2C12 肌 管 细 胞 的IL-1β（P=0.006）和MDA 水平（P=0.002），提高SOD 水平（P=0.0001）；与双氯芬酸钠组比较，1.25 mg/mL 消炎止痛膏抑制LPS诱导的C2C12 肌管IL-1β 水平无显著性差异（P=0.188），但提高SOD（P=0.0001）和抑制MDA 水平（P=0.014）的效果有显著性差异（图5）。

图5 不同浓度消炎止痛膏（2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 mg/mL）和双氯芬酸钠（6.25 μg/mL）作用C2C12 肌管炎 症 模 型24 h 的IL-1β、SOD和MDA 水平A：ELISA 检 测 各 组 细 胞IL-1β 水平 B：各组细胞SOD 含量 C：各组细胞MDA 含量Fig.5 Different concentrations of anti-inflammatory pain relief ointment (2.5 mg/ml, 1.25 mg/ml, 0.625 mg/ml, 0.3125 mg/ml, 0.15625 mg/ml) and diclofenac sodium (6.25 μg/ml),the levels of IL-1β, SOD and MDA in C2C12 myofibers inflammation model for 24h A: Cell IL-1β level in each group detected by ELISA; B: SOD level in each group; C:MDA levels in each group

3 讨论

本团队从事膏摩疗法对急慢性软组织疼痛的机制研究和临床研究，前期临床研究表明以消炎止痛膏为代表的膏摩疗法对软组织损伤患者有良好的治疗效果。本实验在临床研究和动物实验基础上进一步开展体外细胞实验，通过建立LPS 诱导的C2C12 肌管炎症模型[5]，观察不同浓度的消炎止痛膏溶液对LPS诱导的C2C12 肌管致炎过程中的炎症水平和氧化应激状态的影响，探讨膏摩疗法的膏药成分对骨骼肌钝挫伤可能的疗效机制。研究表明，合适浓度的消炎止痛膏溶液可降低C2C12 肌管的IL-1β、IL-6 和MDA 水平，提高SOD 水平。

骨骼肌急性钝挫伤，造成损伤局部肿胀瘀血，肌纤维断裂，肌细胞溶解崩塌，从而导致局部组织炎症反应剧烈。研究表明，骨骼肌损伤和修复是非常复杂的过程，包括逐步的坏死和凋亡、炎症反应、纤维化与肌卫星细胞增殖、血管再生[2,6]。本研究发现，合适浓度的消炎止痛膏溶液可降低C2C12 肌管的IL-1β 和IL-6 水平，从而减轻炎症反应对C2C12 的损害。

机体内氧化剂与抗氧化剂不平衡所产生的氧化应激具有双刃剑作用[7]，低中水平自由基具有充当分子信号调节系列生理过程的作用，如维持血管张力、抵御感染、控制通气等。同时自由基也是脂质、细胞膜和蛋白质及DNA 等细胞结构损伤的中介，可产生次级反应物，诱导细胞坏死、凋亡，最终导致发病。本研究通过对LPS 诱导的C2C12 肌管症模型SOD 和MDA 含量的检测发现，合适浓度的消炎止痛膏溶液可提高C2C12 肌管细胞的SOD 含量，降低MDA 含量，从而减少氧化应激对C2C12 的损害，促进损伤修复。

综上所述，消炎止痛膏成分可降低LPS 诱导的C2C12 肌管炎症模型IL-1β、IL-6 和MDA 水平，提高SOD 水平，可能与减轻组织炎症反应、降低机体氧化应激损害有关。本研究存在一些不足之处，如未开展药物细胞毒性实验等。此外，可运用细胞力学刺激模拟细胞层面的膏摩疗法等。