吸水链霉菌FC-904发酵代谢产物29-O-去甲基雷帕霉素的分离和结构鉴定

杨国新 陈夏琴 余辉 黄洪祥 金东伟 程元荣 黄捷

(福建省微生物研究所，福建省新药(微生物)筛选重点实验室，福州 350007)

西罗莫司(也称雷帕霉素)是一个多用途的药物。吸水链霉菌FC904[1-3](Streptomyces hygroscopicusFC904)在发酵过程中除产生主产物西罗莫司外，同时还合成一些西罗莫司同系物。由于西罗莫司同系物结构与西罗莫司类似，在生产中不易分离，因此成为西罗莫司成品中杂质的主要来源。通过分离纯化获得这些西罗莫司同系物，确定它们的化学结构，一方面将有助于通过优化发酵工艺，降低它们在发酵液中的含量，减少后续分离纯化的成本；另一方面，通过对这些有关物质的控制，也可降低西罗莫司成品中杂质的含量，以便进一步提高西罗莫司产品质量。在前期研究中，我们已经陆续分离并鉴定了一些西罗莫司同系物[4-7]。本文报道另一个西罗莫司同系物FIM-R85的分离纯化和结构鉴定。

1 仪器设备与材料

1.1 实验仪器

制备型液相色谱仪LC-20(日本岛津公司)；高效液相色谱仪LC-2010CHT(日本岛津公司)；核磁共振仪Bruker AM-500；Agilent 1100 series LC/MSD Trap；Bruker APEX Ⅲ7.0 TESLAFIMS高分辨质谱分析仪。

1.2 材料

西罗莫司发酵液粗提物(福建科瑞药业有限公司提供)；200～300目硅胶(青岛永海硅胶有限公司)；乙腈(色谱纯)；甲醇(色谱纯)；去离子水(本实验室自制)；其他试剂均为国产分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 HPLC分析方法

色谱柱：Kromasil C18(5μm, 4.6mm×250mm)；流动相：甲醇∶乙腈∶水(70:15:30,V/V/V)；流速：1mL/min；检测波长：277nm；柱温：40℃。

2.2 FIM-R85的富集

西罗莫司发酵粗提液中FIM-R85含量低， HPLC分析其只占1.1%，且出峰时间与西罗莫司接近(图1)。为便于FIM-R85的分离纯化，首先进行FIM-R85的富集。取西罗莫司的发酵液粗提物30g溶解于二氯甲烷，经硅胶(200～300目)柱层析(5cm×60cm)，二氯甲烷：无水乙醇(40:1,V/V)混合溶剂洗脱，分部收集，用高效液相跟踪检测。将分离得到的含FIM-R85的洗脱液减压浓缩，得到黄色粉末。经HPLC检测，该黄色粉末中FIM-R85占比提高至29.4%(图2)。

2.3 FIM-R85的纯化

图1 粗提物的HPLC图谱Fig. 1 HPLC analysis of crude extract

图2 黄色粉末的HPLC图谱Fig. 2 HPLC analysis of the yellow powder

称取200mg上述含FIM-R85的黄色粉末，将其溶解于少量乙腈中，制备型液相色谱仪LC-20(日本岛津公司)进行分离。分离柱(2cm×25cm)：ODS C18，10μm；流动相：乙腈:水(60:40,V/V)；检测波长：277nm；柱温：25℃；流速：6mL/min。分段收集，HPLC检测。将分离得到的目标组分减压浓缩去除乙腈和甲醇后用等体积的二氯甲烷分别萃取两次，合并二氯甲烷层，减压浓缩除去二氯甲烷获得FIM-R85类白色粉末。HPLC分析表明，其纯度为98.7%(图3)。

2.4 结构解析

FIM-R85的紫外图谱(图4)中可以看出其紫外吸收特征峰与西罗莫司相同，溶解度也与西罗莫司类似；IR谱见图5，其理化性质见表1。

由HRMS测定值显示FIM-R85的分子式为C50H77NO13，分子量为899，比西罗莫司少14；FIM-R85的13C NMR谱(图6)谱线绝大多数呈成对出现，且是一强一弱，从1H NMR谱(图7)中可计算出强弱比例约为9:1，该现象表明：由于结构中酰胺键的旋转受阻，导致该化合物在溶剂d6-DMSO中存在构象异构现象[8]。结合DEPT谱(图8)，并从FIM-R85主要构象体的碳谱可以看出，该化合物分子所含有50个碳原子中，季碳3个，羰基碳5个，次甲基碳20个，亚甲基碳13个及甲基碳9个， 比西罗莫司少1个甲基碳。

图3 FIM-R85的HPLC图谱Fig. 3 HPLC analysis of FIM-R85

图4 FIM-R85的UV图谱Fig. 4 UV analysis of FIM-R85

表2列出了FIM-R85与西罗莫司主要构型的NMR光谱数据对比。与西罗莫司相比，在西罗莫司碳谱中存在的一个甲氧基的碳信号(δ56.89ppm)在FIM-R85的碳谱中消失；相对应的氢谱中西罗莫司具强吸收甲氧基的H信号(3.16ppm)，在FIM-R85的1H NMR谱中也消失。与该甲氧基相关的29位碳的位移也发生变化，由85.49ppm(西罗莫司)移到75.81ppm(FIM-R85)；而29位碳上的氢的位移则由3.93ppm(西罗莫司)移到4.32ppm(FIM-R85)。此外，在FIM-R85的氢谱中，在4.81ppm的位置，多了一个氢信号，经指认，该信号由29位碳相连的羟基氢引起，说明该化合物比西罗莫司少了一个CH2，与其HRMS测定值相吻合。结合其它谱图和理化性质，数据表明FIM-R85是西罗莫司的类似物，其结构为29-O-去甲基雷帕霉素(图9)。

图5 FIM-R85的IR图谱Fig. 5 IR analysis of FIM-R85

表1 FIM-R85的理化性质Tab. 1 Physico-chemical properties of FIM-R85

图6 FIM-R85的13C NMR谱Fig. 6 13C NMR spectrum of FIM-R85

图7 FIM-R85的1H NMR谱Fig. 7 1H NMR spectrum of FIM-R85

图8 FIM-85的DEPT135谱Fig. 8 DEPT135 spectrum of FIM-R85

3 结论与讨论

表2 FIM-R85与西罗莫司主要构型的NMR光谱数据对比a(d6-DMSO)Tab. 2 NMR spectroscopic data for major conformer of sirolimus and FIM-R85a (in d6-DMSO)

续表2

图9 西罗莫司和FIM-R85的结构Fig. 9 The structures of sirolimus and FIM-R85

FIM-R85在西罗莫司发酵液粗提物中含量仅1.1%，采用以硅胶为固定相，二氯甲烷：无水乙醇(40:1)混合溶剂为洗脱剂的富集方法，获得几乎不含西罗莫司而目标物占29.4%的黄色粉末，目标物的比例得到很大的提高。应用制备型液相色谱仪进一步纯化，得到HPLC纯度为98.7%的FIM-R85纯品。理化性质研究和NMR谱分析表明，FIM-R85结构与西罗莫司类似，分子量比西罗莫司少14，与29-O-去甲基雷帕霉素同质。西罗莫司产生菌在生物合成西罗莫司过程中，由聚酮合酶和非核糖体肽合成酶首先合成西罗莫司骨架—前西罗莫司(prorapamycin)，其C-29位为羟基。然后，由甲基转移酶将甲硫氨酸的甲基转移到前西罗莫司的C-29位的羟基上[9]。因此，西罗莫司发酵液中的29-O-去甲基雷帕霉素是西罗莫司产生菌合成的西罗莫司中间产物。Nishida等[10]曾报道在培养基中添加L-哌可酸，从西罗莫司产生菌游动放线菌(Actinoplanessp.)N902-109的发酵产物中分离得到该化合物；而胡方剑等[11]则通过对西罗莫司进行化学半合成的方法也获得该化合物。