玉米粉中戊唑醇基体标准物质的研制

李开瑞, 刘啸林, 李奉杰, 慕建州, 涂晓慧, 程 婷, 贾明宏

(北京农学院生物与资源环境学院1,北京 102206)

(江苏衡谱分析检测技术有限公司2,南京 210046)

(北京诺码标准技术有限公司3,北京 102206)

(天津检通生物技术有限公司4,天津 300457)

农药是有效保障粮食高产的主要措施之一,在粮食生产中起着不可或缺的作用。但农药的盲目使用所带来的农药残留超标问题一直是民众关注的重点,如何更加准确测定出农产品中的农药残留,是食品和农产品安全质量控制的研究热点。因此,农药标准物质以及基体标准物质的研制,对于我国食品安全的质量控制具有重要意义[1]。

戊唑醇属于三唑类农药,以含氮五元杂环为活性基团,抑制真菌甾醇合成。主要用于防治小麦、玉米、花生、蔬菜、水果等作物上的多种真菌病害,一般对白粉菌属、柄锈菌属、喙孢属、核腔菌属和壳针孢属引起的病害均能有效防治[2]。标准物质(Reference Material,RM)是相对于一种或者几种已经得到确证并且适合用于测量测试中的预计功能的特性,稳定性和均匀性均足够的物质,经常作为定性与定量的一种“标杆和量具”[3],是分析检测过程中质量保证的基础。基体标准物质是一种具有实际样品特性的标准物质,即目标物与基体结合,其理化性质与真实检测样品一致,可用于食品分析方法确认和质量控制,并可有效避免基体效应对物质成分检测的影响,进而提高检测结果的准确度[4,5]。现阶段我国对于农残基体标准物质研制较少,截至2018 年,我国的基体标准物质仅有96 种,其中用于有机分析检测的基体标准物质仅有24种[6,7]。顾小红等[8]研制了玉米粉标准物质,牛欣宁等[9]研制了以玉米为基体的伏马毒素 FB1标准物质,孟佳佳等[10]研制了玉米粉中伏马毒素B1和B2基体标准物质,王璐等[11]研制了芹菜中7种农药及其代谢物基体标准物质的制备,截至目前,鲜见玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质的研制报道。

目前,国内已登记的用于防治玉米大斑病、小斑病、灰斑病、丝黑穗病等病症的戊唑醇农药种类已有97种,但国内鲜有玉米中戊唑醇残留的MRL值,本实验选择玉米粉中的戊唑醇作为研制目标,并以欧盟规定戊唑醇在玉米中的MRL值0.02 mg/kg为参考开发了残留分析方法。本研究详细介绍了一种以玉米粉为基体的戊唑醇残留基体标准物质的研制过程和检测方法,适用于粮食中戊唑醇残留含量的检测,并可用于检测过程中的质量控制、实验室能力验证等相关领域。玉米冻干粉具有复溶后理化性质与鲜样保持一致的性质,本研究采用冷冻干燥技术将新鲜玉米籽粒制备成冻干粉进行基体标准物质的研制。通过粉碎、初次冷冻干燥、复溶加标、一次混匀、二次冷冻干燥、粉碎、研磨、过筛、二次混匀、均匀性检验、稳定性考察和定值的方式建立了一套科学简便的玉米粉中农药残留基体标准物质的制备方法,以期为玉米上戊唑醇的的风险评估及MRL值的制定提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇中戊唑醇溶液标准物质[GBW(E)085255,标准值:100 mg/L,相对不确定度 2%];乙腈(色谱纯);无水硫酸镁(分析纯);N-丙基乙二胺(PSA);GCB(石墨化碳黑)填料;氯化钠(分析纯)。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260A-6410B液相色谱质谱联用仪,SQP十万分之一电子天平,TDZ5-WS低速台式大容量离心机,DMT-2500多管涡旋振荡仪,TG16-W微量高速离心机,TJX-410行星式球磨机,XH-C旋涡混合器,A8破壁机,FJ200均质机,LGJ-50FG普通型冷冻干燥机,V-10 V型实验混合机,Milli-Q超纯水仪。

1.3 实验方法

1.3.1 基体标准物质制备流程

本研究研制了一种玉米粉中戊唑醇的基体标准物质,流程图见图1。

图1 基体标准物质制备工艺流程图

本实验选择市场上购买的无戊唑醇残留鲜食玉米为基体样品。称取0.7 kg新鲜的空白玉米籽粒样品,用破壁机将其制成糊状。将制备好的玉米糊倒入冷冻干燥机的托盘内进行干燥处理。冷冻干燥机的预冻条件为:温度-40 ℃,真空压力0.08 MPa,冷冻干燥程序见表1,整个程序时间为46 h。将冻干后的玉米样品转移至行星式球磨机中,对其进行研磨备用。行星式球磨机的设定条件为:正转转速1 800 r/min,持续10 min;反转转速1 800 r/min,持续10 min;循环2次。将研磨好的玉米粉末过60目网筛[8-10],得到500 g玉米干粉空白基体标准物质并检测到鲜食玉米籽粒中水质量分数为20%。

表1 冷冻干燥机冻干程序

将3 L超纯水加入烧杯中,加入1.080 mL质量浓度为100 mg/L的甲醇中戊唑醇溶液标准物质,用均质机混匀。将研磨好的空白玉米粉100 g缓慢加入至烧杯中,搅拌15 min使其完全溶解,重复上述操作,至全部玉米粉溶解在烧杯中。继续使用均质机对玉米浆持续搅拌2 h,使其充分混合均匀。将混合均匀后的玉米样品装入冷冻干燥机的托盘内,进行二次冻干处理。冷冻干燥程序根据表1进行设置。预冻条件为:温度为-40 ℃,真空压力0.08 MPa,整个程序时间为46 h。再次使用行星式球磨机对冻干后的基体样品进行研磨,行星式球磨机的设定条件为:正转转速1 800 r/min,持续10 min;反转转速1 800r/min,持续10 min,循环2次。将研磨好的基体样品过60目网筛,使用混合机进行二次混匀,混匀时间为2 h,转速为24 r/min。

将制备好的基体标准物质在不同部位抽取10个样品,采用液相色谱质谱联用仪对样品中戊唑醇的含量进行检测,每个样品平行测定3次,采用JJF1343—2012标准中规定的均匀性评估方法—单因素方差分析法进行数据统计分析,确定样品是否均匀[12]。

确定样品均匀性良好后,采用棕色西林瓶进行分装,每瓶7 g,-15 ℃条件下进行保存。

1.3.2 基体标准物质中戊唑醇含量的测定

1.3.2.1 基体标准物质的前处理

称取5 g玉米粉基体样品(精确至0.000 1 g)于50 mL塑料离心管中,加入5 mL 超纯水和10 mL乙腈,使用多管涡旋振荡仪3 000 r/min,涡旋10 min。加入5 g氯化钠,3 000 r/min涡旋5 min;使用低速台式大容量离心机3 500 r/min离心5 min。准确吸取1.2 mL上层清液,加入至内含50 mg无水硫酸镁、30 mg GCB及30 mg PSA的2 mL塑料离心管中。3 000 r/min涡旋2 min;使用高速离心机离心10 000 r/min离心2 min。吸取1 mL上层清液,过0.22 μm有机相滤膜后,注入进样小瓶中,用于液相色谱-质谱分析使用。

空白基体标准溶液:称取2份5 g空白玉米粉基体样品(精确至0.000 1 g)分别于50 mL塑料离心管中,其余步骤同基体标准物质的前处理。

1.3.2.2 仪器参考条件

色谱条件:

色谱柱:Eclipse XDB-C18 (3.0 mm×150 mm,3.5 μm);进样体积:10 μL;流速:0.4 mL/min;柱温:30 ℃;流动相:A相:水溶液(0.1%甲酸);B相:乙腈,采用梯度洗脱程序,具体条件见表2。

质谱条件:

离子源:电喷雾离子源(ESI源);扫描方式:正离子扫描(Positive);毛细管电压:4 000 V;干燥器温度:300 ℃;干燥器温度:300 ℃;干燥气流量:10L/min;鞘气压力:30 psi;检测方式:多重反应监测(Multiple Reaction Monitoring,MRM)。MRM离子条件见表3。

表3 MRM离子采集信息

1.3.3 方法学验证

称取5 g空白玉米粉基体样品(精确至0.000 1 g)于50 mL塑料离心管中,准确加入适量的戊唑醇标准溶液,使玉米粉基体中的戊唑醇含量水平约为0.2 mg/kg,混匀、浸泡30 min后进行基体样品的前处理。按上述复原、前处理方法处理加标样品,制得加标回收测定溶液,用于液相色谱-质谱分析。

1.3.4 基体标准物质的均匀性与稳定性检验

1.3.4.1 均匀性检验

采用液相色谱-质谱法对玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质进行均匀性检验。根据JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》,对于均匀性好的样品N≤500,抽取单元数≥10。本次研制的玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质共分装约70瓶,按分装前后顺序,抽取前面部分3瓶、中间部分4瓶、后面部分3瓶共计10瓶样品,将抽取样品进行编号1～10,随机次序进行测定,每瓶样品独立取样,用液相色谱-质谱联用仪对样品进行分析测试,每瓶样品平行测试3次,采用单因素方差分析法对标准物质的均匀性数据进行评估。

1.3.4.2 稳定性检验

稳定性检验分为短期稳定性和长期稳定性检验,因采用棕色西林瓶分装,所以只考虑温度在储存和运输过程中的影响,目的是明确合适的保存和运输条件。

长期稳定性监测的时间间隔为0、1、2、3、6个月,将短期稳定性监测的时间间隔设置为0、1、3、6 d和10 d,每次送检3支样品进行分析测试。为了模拟运输过程中环境温度变化对样品的特性量值产生的影响,故将短期稳定性样品放置在恒温箱中,温度设置为20 ℃与50 ℃。检测结果采用JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》中规定的直线拟合法对数据进行分析,判断基体标准物质的长期稳定性。

1.3.5 基体标准物质的定值

根据JJF 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》中的规定,本次基体标准物质采用8家应用型实验室联合定值的方式。8家实验室均采用1.3.2确定的前处理方法和检测方法进行样品测定。每家实验室平行测定5次,所有检测数据通过正态分布检验、格拉布斯(Grubbs)法以及科克伦(Cochran)法检验后,取总平均值作为研制的基体标准物质的特性量值[13,14]。

1.3.5.1 正态分布检验

将各实验室的数据按有小到大的顺序排列,并依据偏态系数和峰态系数法检验数据是否符合正态分布。计算其偏态系数A和峰态系数B,用于检验不对称性和峰态。

1.3.5.2 格拉布斯(Grubbs)法检验

采用格拉布斯(Grubbs)法检验8家实验室测定结果的平均值是否存在显著性差异。首先计算各家实验的平均值xi-、总平均值x-和各家实验室平均值的标准偏差s,再计算平均值最大的实验室数据的残差vi=xi--x-。再按式(1)进行分析:

λ=|xi--x-|s

(1)

检验结果判定原则为,若λ>λ(α,n)时,则此实验室数据应被剔除。剔除后重新进行格拉布斯(Grubbs)检验。λ(α,n)是与测量次数以及给定的显著性水平α有关的数值。

1.3.5.3 科克伦(Cochran)法检验

采用科克伦(Cochran)法检验8家实验室测定结果平均值间是否等精度。先计算各家实验室各组数据的方差s2i,再计算其中最大方差与所有实验室方差和之比,计算见式(2):

C=S2max∑mi=1s2i

(2)

检验结果判定原则为:若C≤C(5%,8,5),表明各组数据平均值等精度;反之则表明被检验的最大方差为离群值,需剔除后重新进行科克伦(Cochran)检验。

1.3.6 基体标准物质的不确定度评估

定值结果的不确定度由3部分组成,分别为:定值过程引入的不确定度、稳定性引入的不确定度、均匀性引入的不确定度。

1.3.6.1 定值过程引入的不确定度uchar

由8家应用型实验室采用同一种方法对基体标准物质进行定值。按式(3)进行计算:

uchar=sn=∑ni=1(Xi-)2n(n-1)

(3)

1.3.6.2 均匀性引入的不确定度ubb

采用单因素方差分析法对基体标准物质进行均匀性评估,并按式(4)进行计算:

ubb=Sbb=S21-S22n

(4)

1.3.6.3 稳定性引入的不确定度us

采用回归曲线法对均匀性良好的基体标准物质进行稳定性考察,并按式(5)进行计算:

us=s(β1)·X

(5)

1.3.6.4 合成扩展不确定度UCRM

将上述的不确定度分量合成为标准不确定度uCRM,再乘以扩展因子k后,得到基体标准物质的扩展不确定度。

UCRM=K·uCRM=ku2char+u2bb+u2s

(6)

2 结果与分析

2.1 方法学验证

2.1.1 基体标准物质标准曲线绘制

将配制好的标准曲线系列溶液,待仪器稳定后进行检测,每个浓度重复检测2 次,记录峰面积,以峰面积为纵坐标,以浓度值为横坐标,确定标准曲线回归方程,如表4所示。

表4 玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质标准曲线

由表4中可以得出,R2值在0.999以上,表明该农药基体标准物质具有良好的线性关系。

2.1.2 基体标准物质回收率的测定

通过添加适量水平的戊唑醇标准溶液测定其加标回收率,经测定分析,玉米粉中戊唑醇残留分析标准物质的平均回收率为102%,相对偏差为2.08%,满足本次的定值要求,具体结果见表5。

表5 回收率测定结果

2.2 基体标准物质的均匀性检验

随机抽取10 瓶样品进行均匀性检验,每个样品测定3个独立平行,采用单因素方差分析法进行评估,均匀性检验结果表明F实验值(1.26)

表6 玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质均匀性检验结果

2.3 基体标准物质的稳定性检验

2.3.1 长期稳定性

根据稳定性监测原则,对研制的玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质进行为期6 个月的稳定性监测,每次送检3瓶样品进行分析测试。检测结果使用直线拟合法对数据进行处理。

长期稳定性检验结果中|β1|

玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质的长期稳定性检验结果见表7。

表7 玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质长期稳定性检验

2.3.2 短期稳定性

为了模拟运输过程中环境温度变化对样品的特性量值产生的影响,故将样品放置在恒温箱中,温度设置为20 ℃与50 ℃,监测10 d内样品在该模拟条件下的特性量值变化。采用液相色谱-质谱法对模拟实验样品进行测试,测试结果使用直线拟合法对数据进行处理。短期稳定性检验结果:在20 ℃和50 ℃环境下,|β1|

玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质的短期稳定性检验结果见表8。

表8 玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质短期稳定性检验

2.4 基体标准物质的定值

玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质8家实验室的定值检测数据见表9。将各实验室数据的平均值按从小到大排列,进行偏态系数和峰态系数法进行正态分布检验。当n=8时,经计算偏态系数A=0.337;峰态系数B=2.360,对置信概率p=0.95,n=8,查表得偏态系数A1=0.99;峰态检验的临界值区间B1～B′1=1.46～3.70。表明在显著性水平α=0.05上符合正态分布。

表9 8家实验室定值结果

再对各家实验室数据的平均值进行格拉布斯(Grubbs)法检验。经计算,平均值最大的实验室λ=1.44,临界值λ(5%,5)=1.715,λ<λ(5%,5),表明各实验室测定结果间无显著性差异。

最后对各家实验室的平均值进行科克伦(Cochran)法检验。经计算,Cmax=0.343,临界值C(0.05,8,5)=0.359 5,Cmax

故可判断8家实验室的定值检测数据全部通过正态分布检验、格拉布斯(Grubbs)法检验和科克伦(Cochran)法检验。所以选用8家定值单位的总平均值作为该玉米粉中戊唑醇残留分析基体标准物质的特性量值,为0.216 mg/kg。

2.5 基体标准物质的不确定度评估

基体标准物质定值结果的不确定度由3部分组成,分别为:定值过程引入的不确定度、均匀性引入的不确定度和稳定性引入的不确定度。在95%的置信水平下,取扩展因子k=2,与合成不确定度相乘,得到扩展不确定度[15]。

经计算,玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质的不确定度评估结果见表10。

表10 玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质不确定度汇总

2.6 结果表达

玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质的特性量值由定值的总平均值和合成扩展不确定组成见表11。

表11 基体标准物质定值结果(mg/kg)

3 结论

研制了玉米粉中戊唑醇基体标准物质,建立了玉米粉中戊唑醇基体标准物质的制备方法和残留检测方法,简化了制备过程,且使得玉米基质便于长期储存和运输。通过对玉米样品进行一次冷冻干燥、加标混匀、二次冷冻干燥、二次混匀等工艺,采用液相色谱-质谱法测定,经均匀性和稳定性检验后及8家应用型实验室对玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质的特性量值以及不确定度进行了准确的评估,制备了一批均匀性和稳定性良好的玉米粉中戊唑醇残留基体标准物质,其特性量值(以玉米粉计)为(0.432 0±0.030 2)mg/kg(k=2)。为玉米粉中戊唑醇检测的方法开发、质量控制和实验室能力验证以及玉米中戊唑醇最大残留限量的制定提供参考。