不同产地牦牛肉中农残和兽残的含量比较

2023-12-15尹志娜赵雯玮王珊珊朱肖翔朱红波曹叶伟谭宇凡范雪莹罗小菊龙泰华

现代食品科技 2023年11期

尹志娜，赵雯玮，王珊珊，朱肖翔，朱红波，曹叶伟，谭宇凡，范雪莹，罗小菊，龙泰华

（1.广东药科大学公共卫生学院，广东广州 510006）（2.西藏自治区食品药品检验研究院，西藏拉萨 850000）

牦牛（yak）因其能够适应极端恶劣的条件，如寒冷和缺氧，长期以来一直是高原山区畜牧业的主要畜类资源之一。我国的牦牛资源非常丰富，占全世界牦牛总数的95%以上，主要分布于甘肃青海、四川阿坝、西藏自治区等拥有高山地貌的地区[1]。牦牛肉蛋白质和微量元素含量丰富[2]，必需氨基酸的得分与联合国粮农组织和WHO推荐的氨基酸模式接近[3]。同时牦牛生长于绿色无污染的天然放牧环境，几乎不含有害成分，具有极好的营养价值，又因特殊地理环境产量极低，故被誉为牛肉之冠，价格昂贵[4]。大量的投机者以甘肃集中舍饲牦牛或普通牛肉甚至是其他肉源冒充牦牛肉或者牦牛制品获利，导致牦牛肉及其产品成为廉价物品。假冒伪劣牦牛肉及其制品营养与真实牦牛肉相差甚远（图1）。西藏牦牛肉形象骤降，直接或间接对西藏特色产品对外输出产生的经济价值造成巨大影响。目前已经有相应的荧光定量PCR的方法能够精确识别真假牦牛肉以及是否掺入其他源性成分。但西藏特殊地域环境导致本地大多为小规模的散养企业，高成本的荧光定量PCR方法无法有效落地和推广。同时，此法只能判定样品是否为牦牛肉，无法判定其是否属于西藏无污染散牧牦牛肉及其制品。

图1 牦牛肉与普通牛肉营养价值对比Fig.1 Comparison of nutritional value between yak beef and common beef

饲料中含有大量的农作物剩余材料，如谷壳，麸皮或秸秆等。农耕过程中所使用农药会随着饲料进入动物体内[5]。同时，为了提高出栏率，缩短饲养周期，集约养殖过程中抗生素的滥用和乱用，直接导致我国市场上兽药残留超标产品层出不穷。而大量的研究表明农药和兽药残留与各种疾病的发生具有显著相关性。指引中国居民正确选择健康优质的食品，是提高国民健康水平的重要举措。本课题选择了几种典型的农药和兽药作为检测对象，根据现有国家标准方法，对采集的西藏和广州地区的牦牛肉样品进行检测和分析[6,7]，并讨论其是否可以辅助荧光定量PCR鉴定真假藏区散养牦牛肉及制品，或具有同等营养价值产品。

1 材料与方法

1.1 样品采集信息

样品采集信息见表1所示。

表1 样品编号与采集地信息表Table 1 Sample number and collection site information table

1.2 原料与试剂

丙酮、木酒精、乙腈、正己烷、1-丙醇，液相色谱级；乙酸铵溶液、乙酸乙酯、三氟乙酸，分析纯；EDTA-Mcllvainc缓冲液；甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素标准物质；土霉素、四环素、金霉素以及强力霉素标准品，购自阿拉丁试剂有限公司。动物组织核酸提取试剂盒（批号：70089），广东深圳澳东检验检测科技有限公司。

1.3 主要仪器设备

SCIEX 4000 Q TRAP液相色谱-串联质谱仪，爱博才思；3K15离心机，北京博励；ME204E/02电子天平，广州东南科创；N50超微量紫外分光光度计，德国Implen Nano Photometer；7900实时荧光PCR仪，ABI公司；高速台式冷冻离心机，奥豪斯；LC20ADXR凝胶渗透色谱仪，岛津；旋转蒸发器、均质器、氮气吹干仪、带有柱后衍生反应装置和荧光检测器（FLD）的液相色谱仪、高速匀浆机、涡旋振荡器、氮吹仪。

1.4 试验方法

毒死蜱，多菌灵和乐果含量测定：根据GB/T 20772-2008方法进行检验。

克百威含量测定：根据GB/T 23200.112-2018方法进行检验。

双甲脒含量测定：根据农业部781号公告-8-2006方法进行检验。

四环素类含量测定：根据GB/T 21317-2007方法进行检验。

氯霉素类含量测定：根据GB/T 22338-2008方法进行检验。

1.5 牦牛源性成分检测

用核酸试剂盒提取核酸后以三重定量PCR试剂盒对牦牛肉源性成分进行检测。反应体系：检测管中核酸扩增反应液v2，20 μL；牛源性反应液，2 μL；HS-Taq酶，1 μL；样品DNA，2 μL。阳性对照管中核酸扩增反应液v2，20 μL；牛源性反应液，2 μL；HS-Taq酶，1 μL；牛源性阳性对照，2 μL。阴性对照管中核酸扩增反应液v2，20 μL；牛源性反应液，2 μL；HS-Taq酶，1 μL；阴性对照液，2 μL。

扩增步骤参数：预变性温度95 ℃，3 min；变性温度95 ℃，5 s；退火/延伸60 ℃，40 s；40个循环。荧荧光信号采集设置于退火/延伸时。对于多通道荧光PCR检测仪，黄牛源性选择荧光素FAM作为信号采集通道，而牦牛源性则选择荧光素ROX为信号采集通道，淬灭基团选None，染料校正选None。

1.6 数据分析

所有实验至少重复3次，实验结果用平均值±标准差表示。采用Origin 8.0软件作图，SPSS 19.0进行one-way ANOVA单因素分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与讨论

2.1 五种农药检测

实验结果显示（表2），12份随机样本均为检出克百威和双甲脒。克百威是广谱、高效、低残留、高毒性的氨基甲酸酯类杀虫、杀螨、杀线虫剂，在土壤中半衰期为30～60 d，常用于谷类和豆类农作物[8,9]。因谷豆加工过程中的副产物，如麸皮，稻糠，豆粕及秸秆等是动物饲料的主要成分[10-12]，故其可通过饲料喂养进入养殖动物体内，而动物屠宰前农药残留未降解或未被代谢出体外，就会导致肉制品中农药残留超标[13]。通过表2可知，本地普通饲养牛肉和西藏自然放牧牦牛肉中无克百威检出。分析原因主要有：（1）现代化饲料制作多应用发酵技术[14]，发酵过程中克百威可能被生物降解[15]；（2）喷洒在植物中的农药自然环境中被微生物降解[16-18]；（3）进入动物体内后随着新陈代谢排出体外[19]；（4）可能积蓄于肌肉以外部位[19]。双甲脒广谱性杀螨剂，主要用于果树、棉花、蔬菜等作物防治螨类，还可用于牛、羊等牲畜防治蜱螨。本实验并未检测到双甲脒成分，分析原因可能为国家对此类毒性较强的农药监管力度增大，其使用越来越规范。如严格按照休药期时间停止用药。能不用此类农药尽量不用，采用毒性较弱，环境友好性更好的农药种类替代。

表2 不同牛肉样本中毒死蜱、多菌灵和乐果含量结果Table 2 Results of pyrifos, carbendazim and dimethoate content in different beef samples

经检测，乐果、多菌灵和毒死蜱三种农药检测结果均未超过国家标准。藏区样本1～6号和广州样本8号均未检出。广州采集的7号和9～12号样本有不同程度的检出量。分别为：9号样品毒死蜱含量为50.44 μg/kg；多菌灵含量为0.68 μg/kg；乐果含量为7.64 μg/kg。10号样品毒死蜱含量为38.87 μg/kg；多菌灵含量为0.59 μg/kg；乐果含量为4.94 μg/kg。11号样品毒死蜱含量为41.10 μg/kg；多菌灵含量为0.58 μg/kg；乐果含量为7.29 μg/kg。12号样品经毒死蜱含量为60.91 μg/kg；多菌灵含量为0.76 μg/kg；乐果含量为6.23 μg/kg。目前中外研究报道，尚未发现有关西藏牦牛肉与内地饲养牛肉的兽药残对比分析探讨，只有少量关于不同在肉制品中农药残留的对比分析，如李华等[20]用多壁碳纳米管-气相色谱检测了市售的猪、牛、羊肉肉制品的11种有机磷农药。其中敌敌畏、乙酰甲胺磷、氧化乐果、治螟磷、乐果、马拉硫磷、毒死蜱、水胺硫磷、杀扑磷、三唑磷、亚胺硫磷含量分别为0.10、0.19、0.06、0.10、0.05、0.08、0.05、0.12、0.02、0.01、0.04 mg/kg。与本实验结果对比可知，毒死蜱结果吻合，但乐果含量相差10倍。毒死蜱是检测出的残留含量最大的农药，推测有以下几点原因：首先，毒死蜱在中国推广和使用是当时的市场急需取代诸如甲胺磷、甲基对硫磷等高度禁用农药。由于禁用通告的出现，大量低毒的农药纷纷在市场上占据份额。毒死蜱的登记品种就从2006年的215个，到2010年的1100个，以每年约10%的速度递增[10]。其次，毒死蜱的化学结构决定了它的强疏水性，当使用毒死蜱后，可能通过径流等途径污染水环境，还可迅速从水中析出从而富集在土壤中，影响生态环境。由于毒死蜱高效低毒的特性，它已经成为全球使用最广泛的杀虫剂之一，全球都有它的踪迹。这些因素导致了毒死蜱的检出率居高不下。毒死蜱作为高效农药，常作为农作物的农药使用，而副产物如麸皮、秸秆等残留会以饲料进入动物体内。

2.2 抗生素检测

抗生素是畜禽养殖过程中常用的兽药。本实验对牛肉样本中几种四环素类和氯霉素类抗生素的残留量做了检测。结果如表3所示：12份样本氯霉素均无检出，说明我国对抗生素滥用乱用的治理收到显著效果。1～6号样本均无甲砜霉素、氟苯尼考、金霉素和强力霉素残留，7～12号样本均有上述抗生素残留。土霉素除了1、5、6号样本没有残留，其余均有不同程度的残留。而四环素除了2、3、5、10、11号样本，其余均有少量残留。从整体上看，除土霉素和四环素外，其余几种抗生素的1至6号样本和7至12号样本有明显差异性。1至5号样本是来自西藏拉萨市、那曲市、日喀市的放牧牛肉。而6至12号样本是舍饲饲养的牛肉，说明舍饲方法的牛肉抗生素含量比西藏牦牛肉含量高。

西藏位于我国的西北部，地域辽阔，毗邻高原，平均海拔高，早晚温差大，阳光充足，其中拉萨市更是有“日光城”的美名。西藏牦牛肉的食用高不仅体现在优质的蛋白质和微量元素丰富，同时，几乎不含有农药残留和兽药残留，也是其促进人体健康的主要原因。而集中饲养的牛肉为了提高出栏率，往往人为添加到饲料或者直接注射各种化学成分，如抗生素。抗生素残留的原因一般如下：一是中小型养殖场的养殖户的防疫意识不够，防疫设备不齐全，消毒没有做到位，环境条件简陋恶劣等因素，增加肉牛患病的风险。如冬季时，气温低、牛舍卫生脏乱、肉牛的保暖措施不到位，免疫力下降，大肠杆菌、沙门菌等入侵胃肠道，就会引起胃肠道疾病，常用到抗生素给予治疗。二是部分中小型养殖场没有配备兽医、有经验的养殖人员或者兽医的资质不够、专业知识不牢固，在牛群发生疾病或者出现严重传染病时盲目使用抗生素，类似药物剂量使用不准确、给药的途径错误或者搭配药物不当等，进而促进、加重畜禽的感染程度和引起药物代谢不彻底，在牛体内的各个脏器慢慢蓄积。三是四环素类兽用抗生素作用明显、价格低廉、来源易得，有时为了不减慢初生牛犊的成长速度，很多的养殖户会在饲料中添加土霉素、金霉素等抗生素促进牛成长。但对比7和8号样本，来自同一市场的一种普通黄牛，一种品牌优质黄牛，两者的抗生素均有明显的差异性。品牌黄牛中的抗生素多于普通黄牛。原因可能是该品牌的黄牛养殖过程中使用添加了抗生素的饲料，来预防医治疾病和促进黄牛成长，保障黄牛的健康，提高产量。

2.3 牦牛源性成分检测结

已知1～6号采自西藏地区，7～12号采自广州地区。通过三重荧光定量PCR检测方法得到（如表4和图2所示）：1～6号为牦牛肉，7～12号为黄牛肉。实验结果发现，8号样品虽然为黄牛源的伪牦牛肉，但是三种农药参留量同样未检出，且为同等营养价值的绿色无污染养殖的优质黄牛肉。经来源追溯，其为潮汕某牧场散养黄牛肉。其生长环境也属于绿色无污染放牧环境，价格为160～180元/kg，与牦牛肉的市价相近。其余的肉制品三种农药参留量基本与牦牛肉真伪性结果一致。以三种农药参留作为预判断牛肉是否为西藏自然放牧牦牛肉的吻合率达到91.67%，对于评估优质牛肉，吻合率达到100%，因此此方法不会对绿色产品的等级造成影响。以上结果说明农药残留的检测对牛肉的品级和种类分类具有一定的参考价值。即达到农药残留未检出标准的产品，一般被认为其为质量较好的产品。人工饲养的黄牛中由于饲养方式和饲料来源的不同，牛肉中检出的农药含量也各不相同。8号样品为品牌优质黄牛肉，其中所有农药的残留含量均为超出检出限，说明科学使用农药，给肉牛提供清洁的饲养环境，这些都可以使牛肉中的农药残留降到很低的标准。现今肉牛养殖场的大小不一，分布不均，管理起来也难以面面俱到。品牌的肉牛饲养通常在大规模的养殖场进行。养殖场的批准需要当地环境部门的批准，要进行非常严格的生态环境审核。对空气、水质和土壤等都需要进行理化检验，才能确定是否适宜作为养殖场。除了环境部门的参与，当地的畜牧部门也会参与养殖场的设立。依据实际情况和肉牛养殖产业的现状，因地制宜制定肉牛不同生长发育阶段的养殖管理方案，下发给养殖户要求严格执行。

表4 实时荧光PCR检测鉴定表Table 4 Real-time PCR detection and identification table

图2 牛肉鉴别实时荧光PCR荧光曲线Fig.2 Fluorescence curve of real-time PCR for beef identification

通过实验可知目前市售的牛肉制品的农药残留量和兽药残留量基本属于安全级别，即符合国家标准的残留标准。但是跟其他国家比较我国标准对于剂量的要求是比较低的。以毒死蜱为例，我国与CAC要求的MRL值一致，为1 mg/kg，日本的MRL值为中国的一半0.5 mg/kg，欧盟的限量标准最低为0.05 mg/kg。随着我国农药残留和兽药残留检测方法的更新和管理制度与手段的提升，农药和兽药的残留标准线可以向发达国家发展。

本实验中毒死蜱的检出率为41.7%，检出范围为32.11～61.38 μg/kg。1～6号藏区牦牛样品和8号优质黄牛的毒死蜱残留含量低于检出限。含量最高的是12号伪牦牛制品（实为水牛），60.91 μg/kg。本实验的几种农药和兽药残留国家标准限量[21,22]：毒死蜱、多菌灵、乐果、克百威、双甲脒、氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、土霉素、四环素、金霉素、强力霉素含量分别为：1、0.05、0.05、0.05、0.05、0、0.05、0.2、0.2、0.2、0.2、0.1 mg/kg。CAC标准对氟苯尼考、土霉素、四环素、金霉素限量要求均为是0.4 mg/kg。7、9、10、11、12号样品的检出含量均符合国家标准MRL和CAC标准MRL所规定的1.00 mg/kg，但高于日本的最大残留限量0.5×10-6。9号样品和12号样品高于欧盟MRL规定的0.05 mg/kg。5种超过检出限的样品的国家标准的人体每日容许摄入量（ADI），长期摄入会对人体造成损害。本实验中多菌灵检出率为41.7%，检出范围为0.53～0.79 μg/kg。1～6号藏区牦牛样品和8号优质黄牛的多菌灵残留含量低于检出限。含量最高的是12号伪牦牛制品（实为水牛）0.76 μg/kg。7、9、10、11、12号样品的检出含量均符合国家标准MRL和CAC标准所规定的0.05 mg/kg以及欧盟标准MRL所规定的0.1 mg/kg，但高于日本的最大残留限量0.1 mg/kg。本实验中乐果检出率为41.7%，检出范围为4.18～8.12 μg/kg。1～6号藏区牦牛样品和8号优质黄牛的乐果残留含量低于检出限。含量最高的是11号普通黄牛7.29 μg/kg，7、9、10、11、12号样品的检出含量均符合国家标准MRL和CAC标准所规定的0.05 mg/kg。欧盟标准MRL为禁止检出，5种样品高于国家标准的人体每日容许摄入量和日本的最大残留限量0.05 mg/kg。不同地区或者国家的农药残留限量标准可以在一定程度上反映出法律水平或者当地的农业生产制度与条件。其中CAC标准是被各国普遍认可的标准。克百威和双甲脒在我国与欧盟的MRLs中都为0.05 mg/kg，其中双甲脒含量仍高于日本的MRL为0.09 mg/kg[23,24]。由于荧光定量PCR法对于仪器、实验条件和操作人员的要求比较高，成本比较大，西藏牦天然牦牛肉和饲料牦牛肉以及其他伪牦牛的区分存在很大难度。本实验测定的几种农药残留和兽药残留或许可作为辅助鉴别西藏自然放牧牦牛真伪的参考依据。