四株益生菌对非酒精性脂肪性肝病的改善作用

2023-12-15孙怡兰苏维敏汪亦婷张磊刘岛杨天心张婉怡陈姝丹雷欣怡周永芹刘朝奇

现代食品科技 2023年11期

孙怡兰，苏维敏，汪亦婷，张磊，刘岛,，杨天心，张婉怡，陈姝丹，雷欣怡，周永芹,，刘朝奇,

（1.天然产物研究与利用湖北省重点实验室(三峡大学)，湖北省老年胃肠癌精准防治临床医学研究中心，三峡大学第二人民医院，湖北宜昌 443002）（2.三峡大学人民医院，湖北宜昌 443002）（3.肿瘤微环境与免疫治疗湖北省重点实验室(三峡大学)，湖北宜昌 443002）

随着社会的发展，人们生活水平的不断提高，长期高脂、高热量饮食导致的超重、肥胖及一系列代谢相关疾病逐年上升[1]。肝脏作为人体最大的代谢器官，因其受累而引发的多种以代谢紊乱为特征的相关疾病已成为全球严峻的公共卫生问题[2]。

中国是一个典型的“肝炎”高发大国，除病毒性肝炎外，也常见多种非病毒性肝脏疾病，如脂肪性肝炎、自身免疫性肝炎等。脂肪性肝炎根据病因不同可分为酒精性脂肪肝病及非酒精性脂肪肝病（Nonalcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD），其中NAFLD已成为包括中国在内的全球性常见肝脏疾病[3]。长期高脂和高糖饮食、年龄增长、肥胖、II型糖尿病、遗传易感性、代谢综合征、炎症和肠道菌群紊乱等被鉴定为NAFLD常见的危险因素[1,4-7]。近来，有学者提出包括肠道菌群失调、肠源性内毒素血症和代谢性炎症为主的“多重打击学说”，该学说从不同角度解释了NAFLD的部分发病机制[8,9]。

益生菌，指对宿主健康有益的活微生物，当外源性给予一定剂量时能给宿主带来健康益处[10]。益生菌种属众多，常见的主要有乳杆菌属（Lactobacillus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）等。研究表明，补充益生菌有助于平衡肠道菌群、调节免疫力等，有效预防和治疗多种代谢、免疫相关疾病，如慢性炎症性肠炎、NAFLD、哮喘，甚至肿瘤等[10]。益生菌的作用机制除了与病原微生物竞争粘附部位、产生短链脂肪酸、增强黏膜屏障和直接对抗病原体外，还具有调节宿主免疫功能等作用[9,11,12]。因此，补充益生菌有望成为纠正、改善受损的代谢和免疫功能的治疗新方案[13,14]。益生菌的种属、补充方式、剂量、使用者的状态不同，所取得的效果不尽相同[10]。基于此，本研究团队以不同种属益生菌干预高脂高糖饲料喂养的NAFLD动物模型，研究其对常见的代谢性疾病的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

丙二醛（MDA)测定试剂盒（TBA法）（A003-1-2）、总胆固醇（TC/TCH）测定试剂盒（GPO-PAP法）（A111-1-1）、甘油三酯（TG）测定试剂盒（GPO-PAP法）（A110-1-1）、丙氨酸氨基转移酶（谷丙转氨酶/ALT/GPT）测试盒（赖氏法）（C009-1-1）均购自南京建成生物工程研究所。磷酸二氢钾（KH2PO4）（10017608）、磷酸氢二钠（Na2HPO4）（10020318）、氯化钾（KCl）（10016308）、氯化钠（NaCl）（10019308）均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。MRS琼脂和MRS肉汤培养基（青岛海博生物）。一抗：小鼠白细胞介素6（Interleukin，IL-6）（Cat.#: 66146-1-Ig，Proteintech）；二抗：辣根过氧化物酶（Horse Radish Peroxidase，HRP）标记的山羊抗小鼠IgG2b（Cat.#:GB23301，Servicebio）。反转录试剂盒[HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)]（R312-02，Nanjing Vazyme Biotech Co. Ltd.）、定量PCR检测试剂盒（ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，Q711-02，Nanjing Vazyme Biotech Co. Ltd.）。

所用仪器设备包括：干式恒温箱、电热恒温培养箱、干热消毒箱，中国上海福玛实验设备有限公司；Olympus CX31双目生物显微镜、全波长酶标仪，Thermo Electron公司；Vortex-2 Genie涡旋振荡混匀器、超薄切片机、摊片机、烤片机，德国Leica公司；AL-104分析天平、Cascade超纯水仪、VS-1300L-U洁净工作台、79-3型磁力搅拌器，上海泸西分析仪器厂；ND-2000NanoDrop核酸检测仪，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA。

1.2 益生菌及降脂、抗氧化活性分析

河北一然生物科技有限公司生产的商品化冷冻干燥益生菌株：植物乳杆菌LP45（YMC1005）（Lactobacillus plantarum，LP）、嗜酸乳杆菌La28（Lactobacillus acidophilus，La）、鼠李糖乳杆菌LR519（Lactobacillus rhamnosus，LR）、乳双歧杆菌BAL531（Bifidobacterium lactis，Bal）由安琪酵母股份有限公司（Angel Yeast Co. Ltd.）友情馈赠。四株益生菌分别以MRS肉汤（青岛海博）在厌氧罐中初步活化，再以MRS固体琼脂（青岛海博）分离划线，挑取单克隆进行革兰氏染色鉴定后使用。

益生菌的抗氧化活性检测：参考文献方法并略修改[15,16]，将新鲜传代的LP、Bal、La、LR分别以4000 r/min离心5 min洗涤一次，MRS肉汤调整菌液浓度使成2×107CFU/mL，以每孔100 μL加入96孔细胞培养板中，三复孔，37 ℃温箱中孵育3～6 h。取新鲜配制的0.00005、0.0005 mmol/L H2O2溶液，以每孔50 μL加入对应细胞板孔，继续培养16～20 h后测定菌液OD600吸光度值（A）。

益生菌的降脂活性分析：细菌同上法接种96孔板，再分别将不同浓度的胆固醇（Cholesterin，CHO）溶液（0、0.0625、0.125、0.25 g/L）以每孔100 μL加入对应孔板中，37 ℃分别培养24、48 h。收集培养上清液，以商品化的试剂盒按照说明测定上清中CHO浓度。

1.3 实验动物及处理

30只6周龄、雌雄各半SPF级昆明鼠，由三峡大学SPF级动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（鄂）2017-0012，动物实验伦理审核编号2019020Y。小鼠随机分成6组（5只/组）：正常对照组（N）、高脂饲料（High-Fat Diet，HFD）模型组（M）、HFD+益生菌实验组：LP、Bal、La和LR共四组。其中N组给予普通饲料，其它组均给予HFD（以基础饲料:猪油:果糖:胆酸钠:胆固醇:食盐:H2O=0.43:0.2:0.2:0.02:0.04:0.01:0.1按比例混合固定成型，辐照灭菌后备用）[17]，实验周期21 d。此外，根据预实验结果，LP、Bal、La、LR组小鼠每天给予MRS肉汤厌氧条件下培养的200 μL 2×109CFU/mL的对应菌液灌胃，N组和M组小鼠每天给予200 μL生理盐水灌胃。整个实验期间，连续监测小鼠一般状况和体质量变化，并分别记录每组小鼠的日均饮食、饮水量。

1.4 肝脏指数及附睾脂肪测定

实验结束，小鼠称体质量后断颈处死，完整摘取肝脏及附睾脂肪等内脏组织，分别称质量，并按公式（1）计算肝脏指数。一部分肝脏组织置于包埋盒后4%（m/V）多聚甲醛固定，待后续组织切片；余下部分于1.5 mL EP管中迅速置于干冰中，后转置-80 ℃超低温冰箱储存待用。

式中：

HI——小鼠的肝脏指数，%；

W1——小鼠的肝脏质量，g；

W0——小鼠的体质量，g。

1.5 肝脏组织病理及免疫组织化学分析

将多聚甲醛固定24 h的肝组织用常规方法以梯度酒精进行程序化脱水22 h、石蜡包埋、切片（厚度4 μm）、HE染色，以单盲法由专业病理人员在显微镜（奥林巴斯）下观察肝脏组织结构，进行病理分析并取图。

免疫组织化学分析切片经脱蜡至水，冷却后以φ=3% H2O2室温孵育5～10 min消除内源性过氧化物酶活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min后进行抗原修复。滴加小鼠IL-6一抗（1:200）工作液，4 ℃过夜。次日PBS洗涤3次，每次5 min，滴加二抗（1:500）工作液，37 ℃孵育30 min。同前PBS洗涤3次，以DAB显色剂显色，镜下观察并及时终止，苏木素染色后封片、镜检。

1.6 肝组织匀浆生化指标检测

称取-80 ℃冰箱冻存的新鲜肝脏组织50 mg两份，冰上置于组织匀浆器中，加入1 mL无水乙醇备后续总胆固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、丙二醛（MDA）测定，或1 mL PBS用于丙氨酸氨基转移酶（ALT）含量检测。肝组织以3000 r/min离心，每次10 s的条件进行匀浆。将充分研磨后的组织液转移至无菌1.5 mL EP管中，以5000 r/min离心5 min收集上清抽提液，根据试剂盒说明书分别进行上述肝脏生化指标检测。

1.7 RT-PCR检测肝组织中炎症因子的表达

称取冻存小鼠肝组织50 mg，以Trizol法提取肝组织总RNA。经1%（m/V）琼脂糖凝胶电泳（100 V，100 mA，20 min）检测RNA的完整性；NanoDrop分析所提RNA纯度和浓度。以反转录试剂盒按说明书操作获得cDNA；再以通用型高灵敏度染料法定量PCR检测试剂盒进行RT-PCR扩增目的基因。PCR反应体系总体积为20 μL：10 μL PCR Master mix（2×），加入E74样ETS转录因子3（E74 Like ETS Transcription Factor 3，ELF3，又名ESE1、ERT和ESX）和肿瘤坏死因子α（Tumor Necrosis Factorα，TNF-α）上下游引物各0.4 μL，加入cDNA模板1 μL，DEPC水补齐终体积至20 μL，β-actin作为内参。反应条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，39个循环；95 ℃15 s，60 ℃ 1 min，60 ℃ 15 s，共35个循环。结果采用2-ΔΔCT进行定量分析，参照β-actin计算目的基因的mRNA相对表达量。所用引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-PCR

1.8 统计学分析

所有数值均采用平均值±标准误表示。所有数据使用Graphpad Prism 8.0进行单因素方差分析。

2 结果与讨论

2.1 益生菌抗氧化活性

体外培养结果显示，四株益生菌La、Bal、LR和LP在与不同浓度H2O2共孵育16～20 h后，呈现出不同生长浊度，提示其具有一定的抗氧化活性[15]。其中Bal抗氧化能力最强，对0.00005 mmol/L的H2O2抗氧化活性达18.61%，当H2O2为0.0005 mmol/L时，抗氧化活性为11.67%；其余三种益生菌的抗氧化活性依次分别为LR＞La＞LP（图1a）。

图1 益生菌体外降脂活性Fig.1 Lipid-lowering activity of probiotics in vitro

2.2 益生菌降脂活性

胆固醇含量测定结果表明，四株益生菌体外均具有较强的降脂活性，其中La在CHO质量浓度为0.0625 g/L 24 h的降脂率最高可达46.4%，其次是LP（45.75%）；当延长培养时间至48 h时，Bal降脂能力表现相对最强，0.25 g/L的CHO可被有效降脂35.64%，其余三株菌体外降脂活性也基本达到20%及以上（图1b、c）。大量体外和体内研究表明，益生菌可降低胆固醇水平[18,19]。因此，在本研究中，HFD诱导的NAFLD小鼠被用来进一步探究四株益生菌的体内相应生物学功能。

2.3 益生菌改善HFD小鼠一般状态

通过饮食干预以NAFLD为主的代谢相关性疾病，已成为近年科学研究中的新热点。研究发现，嗜酸乳杆菌可通过增强细胞免疫、体液免疫，改善巨噬细胞以及NK细胞活性等方式提高机体免疫功能[20]；鼠李糖乳杆菌具有调节肠道微生物群和抑制病原体、增强免疫应答等功能[21]。为进一步探究益生菌对代谢性疾病的影响，在本研究中，我们评估了四株益生菌对HFD诱导的小鼠NAFLD的缓解作用。

实验期间小鼠一般状态观察，N组小鼠毛发顺滑，有光泽，活动迅速；M组小鼠饮食量增加明显，但毛发并不如N组光泽性好，活动也不如N组多；益生菌干预组小鼠饮食量低于M组，活动较多，毛发较M组顺滑有光泽。其中N组摄食量为2.51 g/d，M组摄食量最高，达8.74 g/d，与N组相比具有统计学意义（P＜0.01）；益生菌干预组小鼠摄食量均较M组低，Bal、La、LR、LP组分别为6.96、7.12、5.94、6.59 g/d，与M组相比具有统计学意义（图2a）。同时，干预组小鼠体质量虽有降低但并不都很显著，说明食物摄入量减少与体质量减轻无严格对应关系，与Wang研究团队[9]的结果一致。

实验期间连续监测小鼠体质量，结果显示M组小鼠体质量增长明显，与N组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。益生菌干预组小鼠体质量较M组有降低，其中Bal组差异显著（图2b）。

肝脏指数分析显示，M组小鼠肝指数（5.10）高于N组小鼠肝指数（4.64），但差异无统计学意义；给予益生菌Bal、La、LR、LP干预组的小鼠肝指数分别为4.33、4.00、5.49、5.51，其中Bal、La组较M组差异具有统计学意义（P＜0.05）（图2c）。

内脏脂肪与肥胖的关系密切[22,23]，体内脂肪过度沉积是导致肝细胞脂肪变性甚至发展为脂肪性肝炎的重要病因[24]。结果显示，N组内脏脂肪含量最低（0.25 g），M组最高（0.71 g），差异具有显著性（P＜0.01）；益生菌干预组小鼠的内脏脂肪质量相较M组均有降低趋势，Bal、La、LR、LP组分别为0.42、0.40、0.27、0.36 g，差异显著（图2d）。

2.4 益生菌调节HFD小鼠的肝脏脂肪代谢

益生菌作为肠道微生物菌群的重要组成部分，近年来吸引了大量科技工作者的研究兴趣。肝细胞受损时ALT水平显著升高[25]。TG、CHO[26]以及脂质过氧化反应的终产物MDA[27]都与体内脂肪代谢密切相关，其含量改变提示脂质沉积和代谢异常。高胆固醇血症、高甘油三酯血症是肝脂肪变性患者中最常见的脂质代谢紊乱指标[28]。实验结果显示M组小鼠肝脏组织匀浆中ALT水平（48.79 U/L）显著高于N组（29.92 U/L），差异具有统计学意义（P＜0.01）。此外，M组的CHO（0.54 mmol/L）、MDA（14.35 mmol/L）和TG（2.39 mmol/L）含量也都明显升高，差异具有显著性（P＜0.01）。给予益生菌干预组小鼠的ALT均显著低于M组（P＜0.05），提示肝功能受损状态有所缓解。与之类似，Bal、La和LR组的CHO、MDA及TG含量相较于M组均显著降低（P＜0.01），而LP组的CHO含量与M组相比差异不具显著性（图3）。

图3 ALT、MDA、TG和CHO含量测定Fig.3 ALT, MDA, TG and CHO contents in mice

2.5 益生菌有效缓解肥胖小鼠的肝组织病理损伤

肝细胞受损、广泛的肝脏炎症是NAFLD患者另一重要临床表现[29]。肝组织切片HE染色结果显示，N组小鼠肝细胞大小均一，肝小叶结构清晰完整，肝索沿中央静脉放射状整齐排列；而M组小鼠肝细胞形态不均一，且肝细胞中出现了明显空泡，肝索结构破坏、排列紊乱，说明NAFLD小鼠疾病模型造模成功[30]。给予益生菌干预组小鼠的肝组织病理变化得到有效改善，肝细胞空泡数量明显减少，肝索、肝小叶结构有所恢复，提示脂肪变性缓解。上述结果共同说明益生菌可有效改善NAFLD小鼠的肝脏脂肪变性，提供肝脏保护作用（图4）。

2.6 益生菌降低NAFLD小鼠肝脏炎症反应

与炎症相关的重要细胞因子TNF-α和IL-6被认为是促成脂肪性肝炎的因素[33]。TNF-α介导了脂肪肝疾病的早期以及向晚期肝病的过渡，并进一步刺激IL-6等炎性细胞因子的释放、招募炎症细胞、破坏肝细胞并启动愈合反应，包括纤维生成等[31]。ELF3是ETS转录因子家族成员，参与炎症、上皮分化和肿瘤发生等多种生理、病理过程[32]。有研究结果显示，益生菌可改善肥胖人群的体质量和健康问题，可降低患者体内的血脂和炎症水平等[33-35]。在本研究中，基因表达水平分析显示，M组小鼠肝组织中炎症相关因子ELF3和TNF-α均显著高于正常对照组，提示NAFLD小鼠肝脏呈现炎症反应状态。与之相反，益生菌干预组Bal、LP的ELF3明显降低（P＜0.05）；La、LR和LP的TNF-α显著下调，差异具有显著性（P＜0.05）（图5a、b）。与之类似，肝脏切片免疫组织化学分析显示，炎症细胞因子IL-6在M组显著升高，益生菌干预组呈现不同程度的降低，其中以Bal组下降最为明显，LP组次之（图5c）。