利用代谢组学方法分析不同糖化条件对酿酒酵母代谢途径以及啤酒中风味物质形成的分析

郭永昊，李倞霆，孙珍，唐文竹

（大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034）

啤酒主要是由麦芽为主要原料添加大米、玉米等辅料酿造的一种富含二氧化碳的低酒精饮料。与啤酒产品风味相关联的风味物质有千种之多，包括醇类、酯类、羰基类、有机酸类、硫化物等，它们之间微妙的平衡关系，构成了啤酒特有的风味。而啤酒品质在生产过程中受到诸多因素影响，制麦、糖化、发酵、后熟等阶段都对啤酒中的风味物质的形成产生深远影响[1,2]。麦汁的糖化是啤酒发酵过程中的关键一步，是将麦芽及其添加的辅料中的不溶性高分子物质或大分子物质（淀粉、蛋白质、半纤维素等大分子物质）通过利用糖化过程中浸出的各种水解酶在适宜的温度、pH值、时间等条件下，逐步分解为可溶性的低分子物质的分解过程，这个过程称为麦汁的糖化。在这个过程中糖化液的物质成分发生了复杂多样的变化，主要包括：淀粉的分解、蛋白质的分解、β-葡聚糖的分解、酸的形成、脂肪的分解和多酚物质的变化[3-5]。

糖化后麦汁的品质将会直接影响麦汁发酵后啤酒品质，迄今为止，已知对啤酒品质产生影响的物质主要有醇类、醛类、酸类、酯类和酮类等，这些物质是评价啤酒品质的一个重要指标[6,7]，它们共同影响着啤酒的质量。因此，糖化后得到的麦汁成分对酵母的发酵和啤酒的口感、非生物稳定性和风味稳定性均有深远的影响。除此之外，啤酒的风味与酵母的发酵也有着密切相关，其中，据文献报道，影响啤酒风味的高级醇主要来自酵母代谢的两个途径，一种是通过氨基酸的异化经Ehrlich机制形成，另一种是先经过糖代谢途径，经氨基酸的合成途径后形成高级醇[13]。

本文通过应用代谢组学技术结合多远分析以及通路分析的方法对不同糖化条件下得到的麦汁和发酵后酒的代谢谱进行了分析，从代谢水平上研究糖化条件对酵母代谢的影响，从而确定不同糖化条件对啤酒风味的影响。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与装置

Agilent UPLC 1290液相色谱仪、G6545B四级杆-飞行时间质谱、G2630A Agilent气相色谱，美国安捷伦。

1.2 主要材料与试剂

国产大麦，产自中国河南；西楚酒花，hBC公司产品；艾尔啤酒酵母S-04，本实验室冷冻管；乙腈、甲酸，均为色谱级，产自默克公司产品。

1.3 分析方法

1.3.1 液相方法色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；正/负离子模式A相：1‰甲酸水/1 mmol/L氟化铵溶液，B相1‰甲酸乙腈/乙腈；梯度洗脱：初始流动相为95% A，0～2 min，95% A；2～20 min，95%～0% A；20～25 min，0% A。

1.3.2 质谱条件正/负离子模式；离子源：AJS；干燥气流速：(11 L/min)/(7 L/min)；干燥气体：350 ℃/325 ℃；雾化器：35 psi/32 psi；鞘气：10 L/min；鞘气温度：350 ℃；毛细管电压：3.5 kV；参比离子（m/z）：121.0509、922.0098；1112.9855、1033.9881

1.3.3 气相色谱条件

检测器和进样口温度均为260 ℃；柱箱升温：初始温度50 ℃（2 min），以5 /℃min升至70 ℃（2 min），以5 ℃/min升至110 ℃，以10 ℃/min升至250 ℃（2 min）；氮气、氢气、空气流量为4.2 mL/min、45 mL/min、450 mL/min；气相色谱柱：HP-FFAP（50 mm×0.32 mm×1.00 μm）。

1.3.4 制麦方法

将大麦在16 ℃湿浸6 h；干浸16 h；湿浸5 h；发芽2～3 d；焙焦50 ℃干燥16 h；60 ℃干燥1 h；70 ℃干燥1 h；80 ℃干燥5.5 h。

1.3.5 糖化方法

方法1：35 ℃（25 min），50 ℃（50 min），62 ℃（40 min），72 ℃（20 min），78 ℃（20 min）；方法2：45 ℃（25 min），55 ℃（30 min），65 ℃（30 min），70 ℃（30 min），78 ℃（20 min）；方法3：45 ℃（30 min），63 ℃（60 min），72 ℃（30 min），78 ℃（15 min）。

1.3.6 发酵条件

焙焦完成后按上述三种方法糖化，糖化后加入质量分数2%的西楚酒花煮沸1 h，调制糖度为9°，加入艾尔S-04酵母至浓度为每毫升106个，20 ℃发酵7 d。每种糖化方法糖化后的麦汁命名为麦汁1、麦汁2和麦汁3；发酵后的酒命名为酒1、酒2和酒3。每种酒分别有12个生物重复，发酵结束后取发酵液经醇沉后稀释进行液质分析。

1.3.7 数据分析

本实验通过气相色谱结合标准品的方法对酒中的乙醇、正丙醇、乙醛、乙酸乙酯和异丁醇等挥发性物质进行了测定；通过液质联用技术对麦汁和酒的其他代谢物质进行了检测。将质谱所得原始数据经过峰对齐，降噪，峰过滤，提取特征值，在提取的数据中选取含有CAS Number或KEGG ID的物质进行缺失值补充等处理；缺失的值用同组数据的平均值进行补充，且当一物质在同组中占比超过80%认为该物质存在。酒和麦汁筛选和补缺后的数据经过无监督的主成分分析（PCA）用来分析样本差异，判断样品是否有分类现象。通过有监督偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）选取VIP值＞1的物质进行通路富集，确定影响较大的代谢通路，以此来确定不同的糖化方法对酿酒酵母代谢产生的影响。

2 结果与分析

2.1 麦汁成分分析

将糖化获取的麦汁经UPLC-Q-TOF-MS分析后，所获取的物质按ChBI（Chemical Entities of Biological Interest）分类原则将代谢物分成35类包括羧酸酯、脂质、醇类、萜类、酮类、氨基酸、醛类、烃类、核苷、低聚糖、糖苷、多糖、单糖、多元醇、醚类、氨基醇、胆碱、肽类、呋喃类、脂肪酸、有机芳香化合物、生物碱、有机酸、吡啶类、酚类、嘧啶、吡喃、有机羟基化合物、内酯、嘌呤、胍类、多胺、苯类芳香化合物和其他类。所分类结果如图1所示。

图1 麦汁中物质种类数量分类柱状图Fig.1 Histogram of classification of substance types and quantities in wort

糖化方法1中有机酸和萜类物质种类最多；糖化方法2中羧酸酯、脂质、酮类、氨基酸、嘌呤和生物碱的种类最多；糖化方法3中内酯、低聚糖、肽类和有机芳香化合物的种类最多。

2.2 主成分分析

主成分分析（PCA）是利用矩阵的线性转换从原始多个变量中选出较少个数的能解释大部分数据的重要变量，即通过数据降维的方法，用几个主成分来体现代谢组学多维数据下的特征[8-10]。PCA得分图（Score Plot）表示样本数据的分类信息，数据越相似的样本在得分图上距离越近。

从图2 PCA分析的结果中可以看出，正负电荷模式下不同糖化方法制备的麦汁之间有明显的分离，而同种方法的麦汁和发酵后的酒之间有明显的聚集。因此可以判定不同方法酒之间的分离主要是由于使用了不同糖化方法麦汁发酵造成的。所以不同的糖化方法会对发酵后的酒的品质有一定影响。

图2 正电模式下不同糖化方法糖化麦汁和发酵后酒的PCA得分图Fig.2 PCA score diagram of saccharified wort and fermented wine in different saccharification methods under positive mode

2.3 物质筛选

为了准确研究代谢物与酒之间的相关性，进一步进行了Biplot分析。Biplot图是由PCA经过坐标变换能够得到样品和物质之间关系的一种可视化方法，在对应样品点周围的代谢物在该样品中的含量最高，反之，与该样品点相反方向的代谢物在该样品中的含量最低。图3是发酵后酒可视化的Biplot图。

图3 正负电模式下PCA的biplot图Fig.3 Biplot diagram of PCA in positive and negative mode

选取图3中黄色样品点周围以及外侧的绿色物质点进行分析，正电选取407种代谢物，负电选取了311种代谢物。将选取得到的716种差异代谢物按ChBI（https://www.ebi.ac.uk/chebi/init.do）分类后结果如图4所示。

图4 Biplot分析后选取物质分类结果Fig.4 Select material classification results after Biplot analysis

结果表明不同糖化条件得到的麦汁经过酿酒酵母发酵后羧酸酯、醇类、氨基酸、有机酸、内酯以及酮类等物质在啤酒中的含量变化较大。其中酯类醇类和有机酸等物质能够直接影响啤酒的风味，尤其是酯类物质对啤酒风味特别是果香味的形成起到关键作用。氨基酸和脂肪酸等物质是风味物质形成的中间体或前体物质；亮氨酸是异戊醇的前体物，异亮氨酸是活性戊醇的前体物，酪氨酸可转化成对氨基苯乙醇（酪醇），色氨酸转化为色醇等[11,12]。

2.4 偏最小二乘判别分析

为了进一步分析不同糖化方法得到的麦汁对酿酒酵母的代谢产生的影响。将选取的差异代谢物进行PLS-DA分析，不同糖化条件得到的麦汁进一步进行发酵后的酒样本在评分图（图5a）上也能有效分离，为了确保模型的准确性对模型进行了100次置换检验（图5b）其中R2=0.0363，Q2=-0.302，符合R2＜0.4，Q2＜0.05的标准，确保了模型的准确性。而要寻找糖化条件对酵母发酵影响较大的关键代谢节点就必须量化每个变量(代谢物)，本文采用VIP值（Variable Importance Plot，变量投影重要性值）来实现量化。VIP值反应了每个变量对模型的贡献率，其值越大表明对应变量对模型的贡献度越大，即在样本组之间所表现的差异越明显，一般选取VIP值＞1的代谢物作为标志性代谢物[13,14]。

图5 （a）差异代谢物PLS-DA评分图，（b）PLS-DA模型验证图Fig.5 (a) PLS-DA score chart for differential metabolism, (b) PLS-DA model validation chart

根据模型的结果，选取VIP＞1的代谢物在酿酒酵母代谢通路上进行通路富集，共富集到了51条代谢通路，选取排名靠前的20条代谢通路如图6所示。从富集的通路结果上发现改变糖化条件之后主要影响酿酒酵母的氨基酸代谢、有机酸代谢以及脂质和脂肪酸代谢等代谢途径；主要涉及到一些基本氨基酸和脂肪酸的代谢通路，如：亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、缬氨酸、脂肪酸、色氨酸、异亮氨酸生物合成途径；甘氨酸、丝氨酸、D-氨基酸、苏氨酸的降解代谢途径。

图6 VIP＞1代谢物在酿酒酵母前20条通路富集图Fig.6 Enrichment of VIP>1 metabolites in the first 20 pathways of Saccharomyces cerevisiae

经过PLS-DA分析后共选取了VIP＞1的物质共有250种，含有KEGG ID的物质有191种，其中能够富集到酵母代谢通路上的共有38种。其中能够富集在氨基酸代谢、有机酸代谢和脂肪酸代谢途径中的物质有13种，如表1所示。

表1 酒中的氨基酸及脂肪酸代谢途径中代谢物VIP＞1代谢物Table 1 Metabolite VIP>1 in a mino acid and fatty acid metabolism pathway

酒中的氨基酸及脂肪酸代谢途径中代谢物VIP＞1代谢物的含量如图7所示，酒1中精氨酸、脯氨酸、5-乙酰氨基戊酸酯、二十碳二烯酸、色氨酸的含量最高；十八烷酸、十六烷酸、十四烷酸、(2R,3S)-3苹果酸甲酯、甘油酸酯、(S)-2-羟基戊二酸盐酒2中的含量最多；2-氧代丁酸、酪氨酸在酒3中最多。

图7 酒中氨基酸及脂肪酸代谢途径中代谢物VIP＞1代谢物含量热图Fig.7 Heat diagram of metabolite VIP>1 in a mino acid and fatty acid metabolic pathway in wine

2.5 代谢网络分析

代谢途径分析是将数据分析得到的结果结合具体的生物代谢系统进行生物学意义的解释。将差异代谢物分析得到的关键代谢节点结合酵母代谢网络分析胞内代谢物与胞外风味物质的对应关系，如图8。

图8 啤酒发酵过程中代谢网络Fig.8 Metabolic network during beer fermentation

啤酒发酵过程中影响啤酒风味的高级醇形成有两条途径：一条是依靠氨基酸的异化作用，通过Ehrlich机制形成高级醇；另一条途径是通过糖代谢途径，经由氨基酸的合成途径生成。异丁醇、异戊醇和活性戊醇的前体物质分别为：缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，这些高级醇的生成和这些对应的氨基酸的代谢密切关联并互相影响[15-17]。

图8表明异丁醇的代谢与缬氨酸的代谢有密切关系，当缬氨酸的含量高时，异丁醇的含量下降与Chen等[15]的研究结论相符。脯氨酸并没有直接参与酵母醇酯代谢，但脯氨酸代谢会影响谷氨酰胺合成，生成的谷氨酰胺在酵母生长时会被利用。酪氨酸、亮氨酸和异亮氨酸等氨基酸类物质在代谢过程中也会生成有机酸或酯类等物质来影响啤酒的风味。酯类特别是乙酸乙酯的合成与相应醇类相关联，这在图8中的糖酵解途径中也有所表明。啤酒中的脂肪酸形成一部分来自于酵母代谢的产生，啤酒在发酵过程时丙酮酸能够经过辅酶A的催化生成脂肪酸。由图8可以看出用不同糖化工艺制备的麦汁发酵成的酒，脂肪酸的含量上也有较明显的差异；例如：十二烷酸、辛酸和二十二碳二烯酸在酒1中的麦汁含量高；十四烷酸、十六烷酸和十八烷酸在酒2中的含量最高。

啤酒成分中的酯类风味物质主要是由酰基辅酶A通过醇乙酰转移酶的作用下与醇类物质发生缩合反应生成相应的酯类风味物质。而酯类物质代谢与脂肪酸代谢对酯基辅酶A存在竞争关系，而麦汁中脂质在发酵过程中会水解产生的脂肪酸，如果代谢流偏向于脂肪酸代谢，必然会影响酯类物质生成[18-20]。如图4中选取酒中差异物质中方法3中酯类的种类最多，因此麦汁中的脂质会影响酒中酯类的生成[21]。

3 结论

本实验通过对不同糖化条获得的麦汁发酵酒进行分析，研究糖化条件对酿酒酵母代谢物的影响。发现改变麦汁的糖化条件以后对麦汁本身的酯类和脂质的种类变化较大，主要体现在羧酸酯、脂质和内酯类物质上。发酵后酒的代谢物通过物质筛选和通路富集分析找出关键的代谢物。通过Biplot分析结果可知，氨基酸类和脂肪酸类物质的变化明显，经过通路富集可知，改变糖化条件以后能够直接在根本上影响糖酵解途径，进而对酿酒酵母的氨基酸代谢、脂肪酸代谢以及乙酸乙酯、异丁醇等风味物质的生成产生一定的影响。改变糖化方法以后，酒1中精氨酸、脯氨酸、5-乙酰氨基戊酸酯、二十碳二烯酸、色氨酸的含量最高；十八烷酸、十六烷酸、十四烷酸、(2R,3S)-3苹果酸甲酯、甘油酸酯、(S)-2-羟基戊二酸盐酒2中的含量最多；2-氧代丁酸、酪氨酸在酒3中最多。利用本研究得到的关键代谢通路，解析其分子机制，挖掘更多的与风味物质形成有关的关键基因和调控因子，将有助于通过分子手段调控啤酒酿造中风味物质的产量。