上皮性卵巢癌组织中CircITGB6、CircPBX3 的表达变化及意义

张艳，韩建秋，田静，王露，邢雅玲，赵明飞，郝丽慧

1 天津泰达医院妇产科，天津 300000；2 天津市第一中心医院妇产科；3 天津医科大学总医院妇产科

卵巢癌是妇科常见恶性肿瘤。2020 年全球卵巢癌发病数达31.4 万例，死亡达20.7 万例［1］。卵巢癌中以上皮性卵巢癌（EOC）最为常见，占所有病理类型的90%。目前EOC 的治疗以手术联合化疗为主，但临床仍会发生肿瘤复发与进展［2-3］。环状RNA（Circ）是具有闭合环状结构的新型非编码RNA 分子，具有保守性、高稳定性、组织特异性等特点，广泛参与宫颈癌、卵巢癌等妇科恶性肿瘤的发生发展，是理想的肿瘤标志物［4-5］。CircITGB6 又称为hsa_circ_0056856，是近年来发现具有免疫调节功能的新的环状RNA 分子，在银屑病［6］、非小细胞肺癌［7］等疾病中异常表达上调，参与疾病的发生发展。CircPBX3 又称为hsa_circ_0004804，近年来有学者在卵巢癌耐药肿瘤细胞中发现CircPBX3 表达上调，是潜在的卵巢癌预后相关肿瘤标志物［8］。为此，我们检测了EOC患者癌及癌旁正常组织中CircITGB6、CircPBX3 表达，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2019 年2 月—2020 年2 月天津泰达医院诊治的80 例EOC 患者为研究对象（EOC组）。纳入标准：①患者均接受卵巢癌根治术，经术后病理检查明确诊断为EOC；②首次诊治，术前无放化疗及免疫治疗史；③临床病历资料完整；④患者及家属能配合完成各项检查，均已签署知情同意书。排除标准：①妊娠哺乳期女性；②合并其他恶性肿瘤；③合并严重肝肾功能障碍、感染性疾病或自身免疫性疾病。患者年龄28～79（62.47 ± 6.17）岁；病理类型：浆液型50 例，非浆液型30 例；肿瘤最大径：＞5 cm 者49 例，≤5 cm 者31 例；肿瘤FIGO 分期：Ⅰ、Ⅱ期44 例，Ⅲ期36 例；肿瘤分化程度：高中分化45 例，低分化35 例；合并淋巴结转移者36 例。所有EOC 患者出院后开始进行随访，电话或门诊方式进行，第1 年每3 个月1 次，第2～3 年每6 个月随访1次，连续随访3年。随访内容为患者生存情况及生存时间。随访截止时间为2023 年3 月1 日。随访终点为EOC患者发生死亡或随访时间结束。本研究经医院伦理委员会批准通过（伦理编号：2023-0215）。

1.2 EOC 癌和癌旁正常组织中CircITGB6、CircPBX3检测 采用实时荧光定量PCR检测癌和癌旁正常组织（距离癌组织≥3 cm）中CircITGB6、CircPBX3表达。将组织于研钵中液氮研磨后，加入TRIzol 提取组织总RNA。紫外分光光度计（Narodrop2000，赛默飞公司）测定RNA 浓度，A260/A280介于2.8～2.1。以总RNA 为模板，进行反转录，反应体系包括模板RNA 1 µL，4×gDNA wiper Mix 4 µL，ddH2O 15 µL；反应程序：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃冷却。Prime-ScriptTMgDNA wiper Mix 反转录试剂盒购自日本TaKaRa 公司。采用实时荧光定量PCR（7900HT实时PCR 仪购自美国ABI 公司）检测CircITGB6、CircPBX3 的相对表达量。引物由深圳华大基因科技有限公司设计合成。CircITGB6 正向引物：5' -GGAGAGGATGGTCAGCCCTA-3'，反向引物：5'-AGACCTGGGGAAAGGAGAGG-3'；CircPBX3正向引物：5'-GCCCTGTTTGAACTTCCTGTTT-3'，正向引物：5'-TTGTGGGTCATTTTGGAGGCT-3'；GAPDH 正向引物：5'-GCCCTGTTTGAACTTCCTGTT- 3'，反向引物：5'-GGTGCCTTGTGTCAGGTCC-3'。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，变性退火延伸共35 个循环。总体系20 µL，包括SYBR Premix Master Mix 10 µL，正反向引物各1 µL，cDNA 1 µL 和ddH2O 7 µL。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算CircITGB6、CircPBX3 的相对表达量。分别以癌组织CircITGB6、CircPBX3 相对表达量的平均值3.17、4.02 为界，将EOC 患者分为CircITGB6高表达（CircITGB6≥3.17，n=39）和低表达（CircITGB6＜3.17，n=41），CircPBX3 高表达（CircPBX3≥4.02，n=38）和低表达（CircPBX3＜4.02，n=42）。1.3 统计学方法 采用SPSS26.0 统计软件。计量资料经K-S正态性检验符合正态性分布时以±s表示，组间比较采用独立样本t检验。CircITGB6 与CircPBX3 之间的相关性采用Pearson 相关。Kaplan-Meier生存分析（Log-Rank检验）分析CircITGB6、CircPBX3 表达对EOC 患者生存预后的影响。Cox 回归模型分析影响EOC 患者预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同卵巢组织中CircITGB6、CircPBX3 表达比较 EOC 癌组织中CircITGB6、CircPBX3 相对表达量分别为3.17 ± 0.57、4.02 ± 0.62，癌旁正常组织中分别为1.06 ± 0.24、1.23 ± 0.32，EOC 癌组织中CircITGB6、CircPBX3相对表达量高于癌旁正常组织（t分别为30.515、35.766，P均＜0.05）。

2.2 EOC 癌组织中CircITGB6 与CircPBX3 表达相关性 EOC 癌组织中CircITGB6 与CircPBX3 表达呈正相关（r=0.685，P＜0.05）。

2.3 不同临床病理特征EOC 患者癌组织中CircITGB6、CircPBX3 表达比较 肿瘤FIGO 分期Ⅲ期、合并淋巴结转移EOC 癌组织中CircITGB6、CircPBX3相对表达量高于FIGO 分期Ⅰ、Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织（P均＜0.05）。见表1。

2.4 癌组织CircITGB6、CircPBX3 表达与EOC 患者生存预后的关系 80例EOC患者随访期间，死亡27例，无失访，3 年总体生存率为66.25%（53/80）。CircITGB6 高表达和低表达者3 年累积生存率分别为51.28%（20/39）、80.49%（33/41），CircITGB6 高表达者3 年累积生存率低于CircITGB6 低表达者（χ2=8.179，P＜0.05）。CircPBX3 高表达和低表达者3 年累积生存率分别为55.26%（21/38）、76.19%（32/42），CircPBX3 高表达者3 年累积生存率低于CircPBX3低表达者（χ2=5.763，P＜0.05）。见图1。

2.5 影响EOC 患者预后的因素 单因素及多因素Cox回归分析结果显示，FIGO分期Ⅲ期、合并淋巴结转移、CircITGB6 高表达、CircPBX3 高表达是影响EOC 患者不良生存预后的独立危险因素（P均＜0.05）。见表2、3。

表2 单因素Cox比例风险回归模型分析结果

表3 多因素Cox比例风险回归模型分析结果

3 讨论

卵巢癌是我国女性常见的恶性肿瘤，每年全国新发病例达5.28 万例，死亡约2.5 万例［9］。EOC 是最常见的卵巢癌类型，具有起病隐匿、恶性程度高、预后差等特点［10］。糖类抗原125、癌胚抗原等是EOC 诊断及预后监测的常用肿瘤标志物，但二者均非EOC 特异性标志物，在月经期、子宫内膜异位症时也可升高，造成假阳性结果［11］。

环状RNA 是一类内源性非编码RNA，具有共价闭合环状结构，发挥转录、剪切、翻译及蛋白质结合等多种生物学功能［12］。研究发现，卵巢癌组织或血清中环状RNA 如hsa_circ_0003972、hsa_corc_0007288 等异常表达，有助于卵巢癌早期诊断及预后评估［13］。本研究中，EOC 癌组织中CircITGB6 表达上调，与不良临床病理特征有关，提示CircITGB6参与EOC 的发生发展。EOC 中CircITGB6 表达升高与套索驱动的环化机制异常有关。研究表明，转化生长因子β 能诱导肿瘤中ITGB6 基因外显子mRNA前体转录过程中的部分重叠，上游内含子和下游内含子的剪切位点反向剪切形成CircITGB6，导致CircITGB6 水平升高［12，14］。有学者发现，卵巢癌中CircITGB6 能与胰岛素样生长因子2 mRNA 结合蛋白2（IGF2BP2）和成纤维细胞生长因子9 mRNA 相互作用，形成RNA 蛋白三聚体复合物，促进肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化，抑制肿瘤杀伤性CD8+T淋巴细胞的肿瘤杀伤效应，促进肿瘤免疫逃逸，而应用CircITGB6 反义寡核苷酸治疗后，能抑制肿瘤细胞的侵袭和迁移，提高实验动物的生存率［15］。本研究中，CircITGB6 高表达是影响EOC 患者不良预后的独立危险因素。分析其原因，一方面是CircITGB6 高表达的EOC 肿瘤细胞侵袭和转移能力强，手术难以达到最大限度减轻肿瘤负担的治疗效果，术后EOC 易复发转移，导致患者不良预后。另一方面，CircITGB6 高表达的EOC 肿瘤细胞对顺铂化疗治疗的敏感性较差，化疗后残留肿瘤细胞也会导致EOC 患者的不良预后［15］。

CircPBX3 是近年来发现新的环状RNA 分子。本研究中，EOC 癌组织中CircPBX3 表达升高，与肿瘤FIGO 分期、淋巴结转移有关，表明CircPBX3 参与EOC 的发生发展。EOC 中CircPBX3 表达升高的机制可能与RNA 结合蛋白驱动的环化机制异常有关。研究表明，RNA 结合蛋白能结合内含子，拉近内含子上游5'剪切位点和下游3'剪切位点之间的距离，促进外显子环化，促进CircPBX3 等环状RNA 的形成［16］。此外，卵巢癌肿瘤细胞中CircPBX3 表达升高能与IGF2BP2 相互作用，增加P 型铜转运ATP 酶mRNA 的稳定性，抑制自噬介导的血管内皮生长因子受体2 的降解，促进肿瘤血管生成及肿瘤转移的发生［8，17］。本研究中，CircPBX3 高表达的EOC 患者生存预后较差，提示CircPBX3是新的EOC预后评估的肿瘤标志物。分析其原因，CircPBX3 高表达的卵巢癌肿瘤细胞铜转运相关蛋白（ATP7A）表达上调，ATP7A 由高尔基体转移到细胞膜上，能外排铜离子的同时，还能将铂类化疗药物排出细胞，导致肿瘤对铂类化疗药物耐药性形成［8］。研究证实，过表达ATP7A 的人卵巢癌细胞系OV-90、SK-OV-3 对顺铂、卡铂及奥沙利铂耐药性较强［18］。本研究发现，EOC中CircITGB6 与CircPBX3 的表达呈正相关，提示二者在EOC 中可能共同促进EOC 的进展。原因可能是CircITGB6 与CircPBX3 均能结合IGF2BP2，激活下游丝裂原活化蛋白激酶及磷脂酰肌醇3 激酶/Akt通路，促进肿瘤细胞的恶性增殖及转移［19-20］。因此，CircITGB6 与CircPBX3 可能在EOC 中发挥协同作用，但二者的具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，EOC 中CircITGB6、CircPBX3 表达升高，与FIGO 分期、淋巴结转移有关，共同促进EOC的恶性进展。EOC 癌组织中CircITGB6、CircPBX3高表达EOC 患者生存预后较差，二者可能成为新的EOC患者预后相关标志物。