口腔鳞状细胞癌组织中miR-138、FOXD1 表达与患者临床病理特征和预后的关系

梁伟腾，王丽娟，刘凡琪，李玲玲，咸钧，牟戎

1 天津市第四中心医院口腔科，天津 300140；2 保定市第一中心医院口腔科；3 吉林市中心医院口腔科；4 天津市第四中心医院麻醉科

口腔癌是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤之一，据报道，2022 年中国口腔癌新发31 733 例，死亡15 745 例［1］。口腔鳞状细胞癌（OSCC）占所有口腔癌的90%以上，目前手术仍是主要治疗方法，但受限于OSCC 的高转移倾向，5 年生存率较低［2］。研究表明，微小核糖核酸（miRNA）能通过调控多种机制参与OSCC 发生发展［3］。miR-138 是一种高度保守的miRNA，miR-138 参与食管鳞癌、膀胱癌等恶性肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭［4-5］。研究报道，miR-138与非肌层浸润性膀胱癌患者预后有关［6］。叉头框蛋白（FOX）D1 是一种转录因子，能通过调控多种基因转录参与恶性肿瘤进程［7］，FOXD1 在OSCC 组织中异常高表达［8］。2014年3月—2023年3月，我们探讨了OSCC 组织中miR-138、FOXD1 表达及与患者病理特征和预后的关系。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2014 年3 月—2018 年3 月于天津市第四中心医院行手术切除的80例OSCC患者癌组织和对应癌旁正常组织（距离癌组织＞3 cm）。患者男52 例、女28 例，年龄≥60 岁56 例、＜60 岁24例；肿瘤最大径：≥3 cm 43 例、＜3 cm 37 例；分化程度：低分化36 例、中高分化44 例；TNM 分期［9］：Ⅰ～Ⅱ期53 例、Ⅲ期27 例；浸润深度≥5 cm 29 例、＜5 cm 51 例；淋巴结转移22 例。纳入标准：①患者或家属书面知情同意；②年龄≥18 岁；③经病理检查确诊为OSCC。排除标准：①非首次确诊，在入院前接受相关治疗；②合并其他部位恶性肿瘤；③资料不完整；④合并血液、免疫系统损害；⑤精神疾病患者。电话或门诊方式对OSCC 患者随访5 年（第1 年每3 个月1 次，后每6 个月1 次），随访至患者死亡或终点时间2023 年3 月，统计5 年总生存率。本研究经医院伦理委员会批准（伦理批号：IRM-DWLL-2019139）。

1.2 癌及癌旁正常组织中miR-138、FOXD1检测 将癌组织和癌旁正常组织剪碎后，加入TRIzol溶液（上海碧云天生物技术有限公司，编号：R0016）振荡混匀提取总RNA，分光光度计测定纯度和浓度合格后，使用TaKaRa反转录试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司，编号：RR014B］反转录为cRNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，编号：D0033）进行扩增。反应总体积：cDNA 1 µL、正反向引物各2.5 µL、2×Hieff®Robust PCR Master Mix 10 µL、ddH2O 加至总体积25 µL；循环参数：94 ℃ 3 min 1 次，94 ℃ 10 s、55 ℃20 s、72 ℃ 30 s循环35次。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计和合成，miR-138 正向引物：5'-GCGAGCTGGTGTTGTGAATC-3'，反向引物：5'-AGTGCAGGGTCCGAGCTATTF-3'；FOXD1 mRNA正向引物：5'-CCTGTCCAGTGTCGAGAACT-3'，反向引物：5'-AAATAGAGGGACCCGCAGAGF-3'；U6正向引物：5'-CGCTTCACGAATTTGCCTCTCAT-3'，反向引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAF-3'；GAPDH正向引物：5'-AATCCCATCACCATCTTCC-3'，反向引物：5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3'。程序完成后绘制熔解曲线，miR-138以U6为内参，FOXD1以GAPDH为内参，2-ΔΔCT法计算组织中miR-138、FOXD1 mRNA相对表达量。通过TargetScan 网站预测miR-138 与FOXD1的结合位点。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，组间比较采用配对或独立t检验；OSCC 组织中miR-138 与FOXD1 mRNA 表达的相关性使用Pearson 相关性分析；不同miR-138、FOXD1 mRNA 表达OSCC 患者生存曲线采用Kaplan-Meier 法绘制，组间生存率比较采用Log-rank 检验；OSCC 患者预后的影响因素使用多因素Cox回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OSCC组织与癌旁正常组织中miR-138、FOXD1mRNA表达比较 OSCC组织、癌旁正常组织中miR-138 相对表达量分别为0.78 ± 0.24、1.23 ± 0.26，FOXD1 mRNA相对表达量分别为2.18 ± 0.40、1.47 ±0.37，OSCC组织中miR-138表达低于癌旁正常组织，FOXD1 mRNA表达高于癌旁正常组织（P均＜0.05）。

OSCC 是一系列基因组和表观遗传改变导致的结果［14］。miRNA 是一类新型的表观遗传改变调控分子，能通过与靶基因完全或不完全互补调控基因表达，进而参与OSCC 发生发展［15］。miR-138 是定位于人染色体3p21.32 上的一个miRNA，既往研究发现，miR-138 能作为免疫功能调节基因维持机体免疫功能，进而参与心血管疾病、神经系统疾病等过程［16］。近年研究发现，miR-138 还参与肿瘤过程，如miR-138能靶向下调Sp1转录因子/富含亮氨酸重复序列G 蛋白偶联受体5 促进结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭［17］；miR-138 能靶向下调表皮生长因子受体促进胆囊癌细胞增殖、凋亡和迁移［18］。已有实验报道，miR-138 在OSCC 中呈低表达，上调miR-138有助于OSCC 恶性进展抑制［19］。有研究指出，miR-138 低表达与乳腺癌、子宫内膜癌患者预后不良有关［20］。本研究结果显示，OSCC 组织中miR-138低表达，与分化程度、TNM 分期、浸润深度和淋巴结转移有关，提示miR-138 表达降低参与OSCC 发生发展。分析原因可能是miR-138 表达降低激活了Zeste 增强子同源物2，促进上皮间质转化，OSCC 细胞转移和侵袭能力增强，导致OSCC 恶性进展［19］。同时miR-138 表达降低会导致γδT 细胞介导的免疫杀伤作用降低，促进OSCC 逃避免疫系统的监视而持续生长［21］。

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图1 miR-138与FOXD1的结合位点

OSCC 指起源于唇黏膜、硬腭黏膜、口底黏膜、舌体黏膜（界沟前2/3）、磨牙后三角区黏膜、牙龈黏膜和颊黏膜等口腔黏膜上皮，并伴有鳞状分化的恶性肿瘤，发病可能与吸烟、饮酒、人乳头瘤病毒感染、咀嚼槟榔、环境、饮食习惯等有关［10］。手术是早期OSCC 的有效治疗方法，但临床超过60%的OSCC患者初诊时即处于晚期；另有10%～40%的OSCC患者伴有隐匿性淋巴结转移，失去手术治疗机会或手术治疗效果欠佳［11］。虽有部分分子靶向药物、免疫检查点抑制剂被用于OSCC治疗，但受限于其高异质性和侵袭性，患者预后仍较差［12-13］。

表1 不同临床病理特征OSCC患者癌组织中miR-138、FOXD1 mRNA表达比较

张爱玲在散文《谈跳舞》中说：“我喜欢反高潮，——艳异空气的制造与突然跌落，可以觉得传奇里的人性呱呱啼叫起来。”以此观照其创作实践，她在叙事中较少采用因果分明的逻辑安排,每当情节即将接近高潮时,总是克制地宕开一笔，以别具慧心的隐喻和象征暗示故事情节的突变和人物命运的陡转。就这样，以非常规、非逻辑、非线性的方式，在看似应当出现高潮的地方不出现这种高潮，在看似应当出现某一种结局的地方不出现这种结局，使叙事更加具有吸引力和表现力，从而达到表现生活本质和剖析真实人性的目的，同时也造成在惊奇之余又能悟到这是意料之外、情理之中的必然的表达效果。

图2 不同miR-138、FOXD1 mRNA表达OSCC患者Kaplan-Meier生存曲线

犹如突然被五百万砸中，她的第一反应不是高兴，而是被砸蒙了，怀疑是假的。颜晓晨愣愣地看着沈侯，迟迟不说话，让沈侯很不耐烦，“到底同意不同意？痛快一点！”

表3 OSCC患者预后的单因素和多因素Cox回归分析结果

3 讨论

2.3 OSCC组织中miR-138、FOXD1 mRNA表达与患者临床病理特征的关系 不同分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移OSCC组织中miR-138、FOXD1 mRNA表达比较差异有统计学意义（P均＜0.05），不同性别、年龄、肿瘤直径OSCC组织中miR-138、FOXD1 mRNA表达比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

2.4 miR-138、FOXD1 mRNA不同表达OSCC患者总生存率比较 80例OSCC患者随访5年，失访4例，死亡36例，5年总生存率为55.00%（44/80）。miR-138高表达者（≥0.78）41例，FOXD1 mRNA高表达者（≥2.18）36例。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，miR-138高表达者、低表达者总生存率分别为65.85%（27/41）、43.59%（17/39），二者比较差异有统计学意义（χ2=5.911，P＜0.05）；FOXD1 mRNA高表达者、低表达者总生存率分别为66.67%（24/36）、45.45%（20/44），二者比较差异有统计学意义（χ2=5.569，P＜0.05），见图2。

2.2 OSCC 组织中miR-138 与FOXD1 mRNA 表达的相关性 经TargetScan 网站（www.targetscan.org）预测，miR-138 与FOXD1 的3'非翻译端2942～2948处存在结合位点（图1）。Pearson 相关性分析显示，OSCC 组织中miR-138 与FOXD1 mRNA 表达呈负相关（r=-0.621，P＜0.05）。

2.5 OSCC 患者预后的单因素和多因素Cox 回归分析结果 排除4 例失访患者，以性别、年龄、肿瘤最大径、分化程度、TNM 分期、浸润深度、淋巴结转移、miR-138、FOXD1 mRNA 为自变量，随访时间为时间变量，生存状态（死亡/存活=1/0）为因变量，建立多因素Cox 回归模型。结果显示，低分化、TNM 分期Ⅲ期、浸润深度≥5 cm、淋巴结转移、FOXD1 mRNA≥2.18 为OSCC 患者死亡的独立危险因素，miR-138≥0.78 为独立保护因素（P均＜0.05）。见表3。

FOX 是一类转录调节因子家族，参与代谢、胚胎发育、组织分化、免疫调节等多个生命过程，其家族成员异常表达在恶性肿瘤进展过程中发挥抑癌或促癌作用［6］。FOXD1 定位于人染色体5q13.2，能激活脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信号通路，进而促进胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭［22］；沉默FOXD1 能抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路激活，进而抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭［23］。有研究报道，FOXD1在OSCC 组织中差异表达［24］。本研究结果显示，OSCC 组织中FOXD1 mRNA 高表达，与分化程度、TNM分期、浸润深度和淋巴结转移有关，提示FOXD1 mRNA 表达升高参与OSCC 发生发展。分析原因可能是FOXD1表达升高能激活锌指转录因子诱导OSCC 细胞上皮间质转化，增强OSCC 细胞迁移与侵袭能力，进而促进OSCC恶性进展［24］。

5.强化宽带保障。加强信息基础设施建设，持续推进宽带中国战略，实施重庆全光网络城市建设，促进网络提速降费，为商贸流通业线上线下互动创新发展提供网络支撑。切实加强区县农村地区信息基础设施建设，大力推进“宽带乡村”“行政村通光纤”工程，加快实现行政村通光纤全覆盖，探索5G网络有效覆盖由场镇区域向乡村拓展，提升农村地区网络通信发展水平。

本研究通过在线网站预测发现，miR-138 与FOXD1 存在碱基互补关系，相关性分析发现miR-138 与FOXD1 mRNA 在OSCC 组织中表达呈负相关，提示miR-138 与FOXD1 可能共同参与OSCC 发生发展。刘东等［25］实验证实，上调miR-138 能靶向下调FOXD1表达，进而抑制OSCC细胞增殖和侵袭。本研究通过随访发现，miR-138 高表达和FOXD1 mRNA 低表达OSCC 患者5 年总生存率升高，且FOXD1 mRNA≥2.18 为OSCC 患者死亡的独立危险因素，miR-138≥0.78 为独立保护因素。说明OSCC组织中miR-138、FOXD1 mRNA 表达与患者预后密切相关。

综上所述，OSCC 组织中miR-138 表达降低，FOXD1 mRNA 表达升高，与分化程度、TNM 分期、浸润深度、淋巴结转移和预后有关，二者可能成为OSCC患者预后标志物。