超高效液相色谱-大体积流通池荧光法检测配方乳粉中维生素A 及维生素E

冯寅洁，黄银波，周小清，陈伟，胡慧，蔡霞，乔勇升

（泰州市食品检验院，江苏 泰州 225300）

0 引 言

脂溶性维生素是机体维持生命活动必需的营养物质。维生素A 又称视黄醇，具有促进视觉发育、维护上皮细胞稳定和促进骨骼生长等功能[1-2]。维生素A 缺乏是世界卫生组织(WHO)公布的全球四大营养素缺乏症之一。机体因无法自主合成维生素A，若日常饮食不当，会造成维生素A 不足[3]。维生素A 对光、氧气、酸和高温较敏感[4]，通常以相对稳定的维生素A 醋酸酯或维生素A 棕榈酸酯等作为营养强化剂加入食品中。维生素E 又名生育酚，其中以α-生育酚的生物活性为最高[5]。维生素E 具有抗氧化、抗衰老和促生育等功能[6-7]，可保护大脑神经元、预防和治疗炎症[8-9]。α-生育酚或混合生育酚可作为食品中的抗氧化剂或营养强化剂。正常人群中很少出现维生素E 缺乏症，多出现在脂肪代谢障碍或脂肪吸收不良的群体中[10]。如果过量服用同样会引起健康问题，如维生素A 过量摄入可能导致肝脾肿大、颅内压增高等[10]，维生素E 长期超剂量摄入可能造成胃肠功能紊乱等[11]。为充分保证婴幼儿配方食品营养有效性和保障婴幼儿营养的安全性，2023 年实施的婴幼儿配方食品系列标准修改了产品中维生素A 和E 含量的最小值和最大值。准确测定配方乳粉中维生素的含量，成为生产企业和检测机构工作的重点。

现阶段根据食品安全国家标准[12]，实验室广泛采用的检测方法主要是液相色谱法。配方乳粉基质复杂，提取维生素A、E 需要先经过皂化、萃取、水洗、浓缩等步骤，但皂化不完全、萃取和水洗易乳化等问题严重影响脂溶性维生素的提取效果，脱水和定容过程的多步操作增加了有机溶剂的挥发，且易导致维生素损失率加大。刘慧敏等[4]用薄层层析法分离母乳中的维生素A 和E，李彬等[13]用固相萃取代替液-液萃取提取乳粉中脂溶性维生素，K PRZYGODA 等[14]用超临界流体萃取法提取种子油中生育酚，这些方法尚处于探索阶段，未被广泛应用。测定脂溶性维生素含量的方法有分光光度法[15]、气相色谱法[16]、液相色谱法[17-18]、气质联用法[19]、液质联用法[20]等。维生素A 和维生素E都含有环状结构和长的脂肪族烃链，该体系离域电子易激发，具有荧光性[21]，可根据此种特性用荧光法测定，与紫外法相比，特异性强、干扰少、检出限更低。本文以配方乳粉为基质，探索建立有针对性的前处理条件，采用超高效液相色谱串联大体积流通池荧光检测器测定维生素A 和E 的含量。与国标液相法相比，可减少皂化不完全、容易乳化和多步操作致目标物损失等问题，检出限明显降低。该方法可操作性强、重复性好、灵敏度高，能够满足对配方乳粉的脂溶性维生素进行批量准确分析的要求。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与材料

视黄醇标准品（纯度98.0%），上海麦克林生化科技有限公司；α-生育酚标准品（纯度99.9%），坛墨质检科技股份有限公司；甲醇（色谱纯），德国Merck 公司；无水乙醇、氢氧化钾、抗坏血酸、2, 6-二叔丁基对甲酚（BHT）、石油醚（分析纯），国药集团化学试剂有限公司；婴幼儿配方乳粉质控样品，大连中食国实检测技术有限公司；配方乳粉，市售。

1.1.2 仪器与设备

ACQUITY H-CLASS UPLC 超高效液相色谱仪串联二极管阵列（PDA）检测器和大体积流通池荧光检测器，美国Waters 公司；XS204 电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；岛津UV-2550 紫外可见分光光度计，岛津（上海）实验器材有限公司；Milli-Q Reference 超纯水机，美国Millipore 公司；SHA-C 恒温振荡器，常州国华电器有限公司；RV 10 basic 旋转蒸发仪，德国IKA 公司。

1.2 方法

1.2.1 样品处理

称取5 g 配方奶粉于锥形瓶中，加入20 mL 45～50 ℃水，混匀，再加入1.0 g 抗坏血酸和0.1 g BHT，混匀，依次加入30 mL 无水乙醇和20 mL 50%氢氧化钾溶液，边加边振摇，混匀后于80 ℃恒温水浴振荡皂化40 min，皂化后立即用冷水冷却至室温。用石油醚100 mL 萃取两次，合并萃取液，分别用100 mL 水洗3次，收集醚层，在40 ℃减压旋蒸至瓶内醚液约1～2 mL时取下旋蒸瓶，用氮气吹至近干。准确加入10 mL 甲醇，超声溶解瓶内残渣并混匀，过0.22 μm 有机系滤膜，待上机测定。

1.2.2 标准工作溶液配制

准确称取适量维生素A 和维生素E 标准品，分别用无水乙醇溶解并定容至50 mL，配成维生素A 浓度约0.5 mg/mL、维生素E 浓度约1 mg/mL 的标准储备液。临用前参考GB 5009.82—2016 附录方法对储备液进行校正，得出准确浓度[12]。分别吸取维生素A 标准储备溶液1.00 mL 和维生素E 标准储备液5.00 mL 于同一50 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到维生素A 和维生素E 混合标准中间液，将标准中间液用甲醇进行稀释，配成维生素A 浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，维生素E 浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg/mL 的标准工作液。

1.2.3 液相色谱条件

Waters ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm, 1.8 μm），柱温30 ℃；流动相为甲醇-水（V甲醇∶V水=95∶5）；流速0.4 mL/min；进样量2 μL；二极管阵列检测器波长：维生素A 325 nm，维生素E 294 nm，扫描波长190～400 nm；荧光检测器维生素A 激发波长328 nm，发射波长440 nm；维生素E 激发波长294 nm，发射波长328 nm。

1.3 数据处理

每个处理做6 次平行。借助Empower 3 色谱数据软件分析色谱图，检测数据通过Excel 软件处理，绘图和分析采用Origin 2018 软件。

2 结果与讨论

2.1 皂化条件的优化

脂溶性维生素对外界条件如光照、氧气等敏感，试验过程应注意避光，减少样品在空气中暴露的时间。皂化过程除去了乳粉中脂肪的干扰，将脂溶性维生素从乳脂肪中脱离出来，并将维生素酯类化合物转化为同一形态的维生素[11]，从而提高提取效率，便于分析和定量。分别对加碱量、皂化温度和皂化时间进行单因素优化，其余操作参照1.2.1，以配方乳粉中维生素A 和E 的测定值作为考察指标。

2.1.1 加碱量

分别添加50%氢氧化钾溶液5、10、15、20、25、30 mL，80 ℃皂化40 min，考察加碱量对配方乳粉维生素A 和维生素E 测定值的影响。试验发现，加入5 mL碱液的处理组皂化液中有较多棕色或黑色沉淀，溶剂萃取后分层不理想。不断提高碱液量，皂化液中沉淀减少，液体色泽趋于均匀的棕色，当加碱量达到15 mL 及以上时，皂化效果理想，溶剂萃取后有明显的分层。如图1 所示，随着碱液量的增加，维生素A 和维生素E测定值均不断提高。当碱液添加量为20 mL 时，维生素A 和维生素E 的测定值趋于稳定，说明皂化反应基本完全。

图1 加碱量对配方乳粉维生素测定值的影响

2.1.2 皂化温度

添加碱液20 mL，分别在60、65、70、75、80、85、90 ℃皂化40 min，皂化温度对配方乳粉维生素A 和维生素E 测定值的影响如图2 所示。随着皂化温度升高，维生素A 测定值逐渐增加，80 ℃皂化处理组的维生素A 测定值最高，之后维生素A 测定值略下降；维生素E 测定值随着皂化温度上升而不断增加，在80～90 ℃高温环境下性质较稳定。试验表明，提高皂化温度有利于加速皂化反应，但是过高温度可能会影响维生素的稳定性[22]，特别是视黄醇结构会被破坏[23]，维生素A 测定值减小。综合考虑2 种维生素测定值的变化趋势，确定皂化温度为80 ℃。

图2 皂化温度对测定值的影响

2.1.3 皂化时间

添加碱液20 mL，在80 ℃分别皂化30、35、40、45、50、55、60 min，皂化温度对配方乳粉维生素A 和维生素E 测定值的影响如图3 所示。随着皂化时间的延长，维生素A 测定值先升高后下降，皂化40 min 处理组的维生素A 测定值最高，之后测定值逐渐降低；皂化时间达到40 min 后，各处理组的维生素E 测定值为13.49～13.62 mg/100 g，在P=0.05 水平下，无显著性差异。结合测定结果和实验效率，选择皂化时间为40 min。

图3 皂化时间对测定值的影响

岑建斌等[24]提取婴幼儿乳粉中脂溶性维生素，选择55%氢氧化钾溶液于55 ℃皂化1 h。尹丹阳等[25]测定肉制品中脂溶性维生素，选择50%氢氧化钾溶液于80 ℃皂化30 min。王天娇等[26]检测保健食品中维生素D3，发现低于80 ℃需要延长皂化时间，高于80 ℃容易使待测物质氧化。通过观察皂化效果和考察维生素A 和维生素E 测定值的变化趋势，本文选择50%氢氧化钾溶液20 mL 于80 ℃皂化40 min 为最佳皂化条件。

2.2 提取、洗涤和浓缩条件的优化

比较正己烷、石油醚、石油醚-乙醚混合液（V石油醚∶V乙醚=1∶1）萃取皂化液发现，对于反应较完全、沉淀较少的皂化液用3 种溶剂萃取均可呈现明显的分层，而皂化反应不完全、有较多沉淀物的浑浊液体用石油醚-乙醚混合液萃取后分层效果最好，正己烷、石油醚萃取后中间有乳化层。正己烷毒性较其他2 种溶剂大，单个样品萃取需200 mL，大量使用对人体和环境有害。皂化条件经过优化后反应较完全，因此本试验选用石油醚作为提取溶剂。

用100 mL 水洗涤醚层，待分层后弃去下面的水层，再重复水洗2 次，可将醚层由碱性洗至中性。GB 5009.82—2016 未明确水洗的具体操作方法。试验发现，初次和第2 次水洗若按液液萃取方式振摇，容易出现乳化现象。多次尝试后认为，初次可竖直持分液漏斗顺时针或逆时针方向轻轻摇动，静置待分层。第2 次可持分液漏斗两端，缓慢上下颠倒，静置。第3次水洗可适当加大幅度进行斜面振荡。每次水洗振荡几次后需及时打开分液漏斗顶塞或活塞放气，避免气液混合物在压力下冲出塞子造成目标物损失。

国标方法中醚液需经无水硫酸钠脱水。实验发现脱水速度较慢，石油醚通过无水硫酸钠时易挥发到空气中，且需再用石油醚洗无水硫酸钠，操作时间较长。本实验在水洗后弃去水层，可向下放一点醚层以完全冲去分液漏斗中的水。若漏斗颈内壁附着水滴，可塞入细滤纸条吸除。然后将醚层放入旋蒸瓶中，再用少量石油醚冲洗分液漏斗，并入旋蒸瓶。此法省去了用无水硫酸钠脱水的步骤，操作简单、便捷，石油醚的损失较国标方法少。减压浓缩、氮气吹至近干后直接准确加入10 mL 甲醇，避免多次溶解转移至容量瓶，从而减小损失。

2.3 流动相条件的选择

配方乳粉中维生素E 的检出形式一般只有α-生育酚，不需要分离异构体，本试验选用HSS T3 色谱柱，流动相采用等度洗脱模式。比较了甲醇、甲醇-水（V甲醇∶V水=95∶5）、甲醇-水（V甲醇∶V水=90∶10）为流动相，流速0.4 mL/min 时目标物的出峰时间。发现甲醇洗脱下，维生素A 出峰时间太快，与干扰峰相近，影响定量。甲醇-水（V甲醇∶V水=90∶10）条件下，维生素E 出峰时间在20 min 左右，进样时间较长。综合考虑，选择流动相条件为甲醇-水（V甲醇∶V水=95∶5），进样时间为18 min。标准溶液和样品溶液荧光色谱图分别如图4、图5 所示。

图4 标准溶液荧光色谱

图5 样品溶液荧光色谱

2.4 线性关系、检出限和定量限

将标准工作溶液按浓度由低到高依次进样，比较用大体积流通池荧光检测器和二极管阵列检测器测定，维生素A 和维生素E 响应值的差异。以峰面积为纵坐标Y，浓度为横坐标X 制作标准曲线，并计算线性相关系数r。分别以3 倍信噪比（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）确定检出限和定量限。由表1 可见，维生素A 和维生素E 通过荧光法和紫外法测定的线性关系良好，相关系数r 均大于0.999。本试验用2 种检测器测定维生素A 和维生素E 的检出限均比GB 5009.82—2016 第一法的低，特别是荧光法大大降低了维生素E 的检出限，测定维生素E 的灵敏度是紫外法的30 倍。脂溶性维生素特别是维生素E 含量较低的样品可用荧光检测器测定。

表1 维生素A、E 的线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.5 回收率和精密度

按照1.2.1 前处理，测定配方乳粉基质中维生素A、维生素E 含量，再分别向配方乳粉中加入3 个浓度水平的维生素A、维生素E 混合标准溶液，基质样品和每个加标水平的样品重复测定6 次。经检测，配方乳粉基质中维生素A 为476 μg/100g，维生素E 为13.56 mg/100g。加标回收率结果如表2 所示，2 种脂溶性维生素的加标回收率为85.2%～103.4%，相对标准偏差为2.5%～5.6%。

表2 维生素A、维生素E 加标回收率及相对标准偏差（n=6）

2.6 样品测定

采用本方法检测10 批配方乳粉，测定值、标示值、测定值与标示值的比值R 如表3，其中样品编号1 号为婴幼儿配方乳粉质控样品，2～4 号为女士配方奶粉，5～7 为中老年配方奶粉。质控样品的测定值与标示值接近，表明该方法测定的结果准确可靠。依据GB 28050—2011《食品安全国家标准预包装食品营养标签通则》，食品中的维生素A 允许误差范围为80%～180%的标示值，食品中维生素E 允许误差范围为不低于80%的标示值。表3 中，2～7 号配方乳粉中维生素A 测定值与标示值的比值R 为89%～110%，维生素E 的比值R 为92%～120%，均符合标准要求。

表3 样品测定值与标示值的比较

3 结 论

优化了配方乳粉基质中提取维生素A 和维生素E 的皂化条件，如加碱量、皂化温度和皂化时间等，解决了皂化不完全的问题，避免在长时间的强碱、高温环境下维生素大量损失。提取、水洗和浓缩条件是在GB 5009.86—2016 第一法的基础上，结合实际操作经验得出的优化方法，能有效避免乳化现象，减少多步操作带来的误差。

采用紫外法检测，同一浓度下，维生素E 的响应值明显低于维生素A，峰型不如维生素A 尖锐。建立了超高效液相色谱-大体积流通池荧光检测器测定配方乳粉中维生素A 和维生素E 的方法。大体积流通池荧光检测器专属性强、杂峰干扰少，可显著提高目标物的响应值。试验中荧光法测定维生素A 检出限0.6 μg/100 g、维生素E 检出限0.8 μg/100 g，均明显低于国标第一法的检出限。方法加标回收率和精密度良好，适用于多种系列配方乳粉中维生素A 和维生素E 的含量测定。