冷链食品中铜绿假单胞菌的检测方法研究及进化树构建

柯振华

福建省产品质量检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心（福州），福州 350000

冷链食品是指在产品加工、贮藏、运输、分销和零售和到消费者手中，其各个环节始终处于产品所必需的低温环境下，以保证食品质量安全，减少损耗，防止微生物污染的特殊供应链系统。冷链食品包括但不限于易腐食品，如肉类、禽类、鱼类、蛋类、奶制品等［1-3］。

铜绿假单胞菌又称绿脓杆菌，属于非发酵革兰氏阴性杆菌，广泛分布于人类皮肤、肠道和呼吸道等，是临床上常见的条件致病菌之一［4］。铜绿假单胞菌菌体细长且长短不一，有时呈球杆状或线状，成对或短链状排列。在临床医学中，铜绿假单胞菌容易引发患者术后的伤口感染，对于烧伤患者严重时可能会造成死亡［5-8］。

目前，国内对于铜绿假单胞菌的检测主要基于微生物传统培养分离鉴定方法［9-13］，其操作步骤复杂、流程多且对检验人员的检测经验要求很高，容易出现假阳性或者假阴性结果，因此亟需开发更加高效科学的检验方法。同时，国内对于食品中铜绿假单胞菌的检测主要集中于包装饮用水或者桶装饮用水［14-17］，对于其他类别食品特别是冷链食品中铜绿假单胞菌的检测，未见相关研究报道。本研究基于分子生物学方法，拟开发冷链食品中铜绿假单胞菌的实时荧光定量PCR 检测方法将其应用于实际样品抽样检测工作中，并构建了铜绿假单胞菌生物进化树，以期为解决铜绿假单胞菌污染溯源问题提供创新性的研究方法与思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 标准菌株 铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌等标准菌株均来自于福建省产品质量检验研究院菌种保藏室，采用磁珠法冻存。

1.1.2 样品采集 冷链食品如冷鲜肉类、速冻水产品等样品均随机采集自市场，用无菌袋封装后置于冷藏保温箱中，运输至实验室后，在二级生物安全实验室开展铜绿假单胞菌检测研究工作。

1.1.3 试剂 微生物培养基等试剂购自北京陆桥技术股份有限公司；TaqProbe PCR-Multiplex Mix预混液，柱式细菌基因组DNA 抽提试剂盒等购自生工生物工程（上海）股份有限公司。实时荧光PCR检测所需引物探针委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 仪器与设备

实时荧光定量PCR 检测系统（ABI 7500）；小型离心机（Eppendorf）；生物安全柜（Baker）；微生物鉴定药敏系统（梅里埃）。

1.3 实验方法

1.3.1 预增菌 称取25 g试样加入225 mL SCDLP液体培养基，置于36 ℃培养18 h。

1.3.2 试剂盒法提取菌液DNA 在完成预增菌后，按照试剂盒说明书应用柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒提取预增菌液中的菌体DNA。

1.3.3 引物与探针的设计与合成 本研究依据铜绿假单胞菌的保守基因序列设计引物和荧光标记的探针，具体见表1。

表1 引物和探针序列Table 1 Sequences of primers and probes

1.3.4 实时荧光PCR 检测反应体系与反应参数反应体系：10×PCR 缓冲液5 μL、25 mmol·L-1氯化镁溶液4 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、正反引物各（10 μmol·L-1） 1 μL、探针（10 μmol·L-1） 1 μL、Taq酶1 μL、模板DNA 3 μL、ddH2O 31 μL。反应参数：94 ℃ 5 min；94 ℃ 15 s，59 ℃ 1 min，共45 个循环。

1.3.5 PMA-qPCR 检测目标病原菌的灵敏度 经同步涂布平板检验，取铜绿假单胞菌菌液浓度为107CFU·mL-1，逐级稀释，最终制备成梯度浓度分别为106、105、104、103、102、10 CFU·mL-1的稀释菌液，采用上述实时荧光PCR 检测反应体系和反应参数进行检测，以确定方法检测灵敏度。

1.3.6 冷链食品中铜绿假单胞菌的检测分析 从市场中采集了不同类型的冷链食品共计271 份样品，采用实时荧光PCR检测方法开展检测工作。

1.3.7 铜绿假单胞菌溯源分析以及分子进化树的构建 将冷链食品中分离得到的铜绿假单胞菌菌株进行分离纯化，通过基因测序获得细化后菌株的16S rRNA 序列，其余用于构建菌株分子进化树的假单胞菌属16S rRNA 序列均检索自美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）数据库，具体序列信息见表2。

表2 分子进化树构建所用假单胞菌属菌株序列信息Table 2 Sequence information of Pseudomonas strains used in molecular tree construction

使用BioEdit 软件对实验室分离所得的铜绿假单胞菌基因序列以及NCBI 中搜索得到的基因序列进行处理，利用Clustal W软件对基因序列进行整合比对分析，利用MEGA X 软件构建铜绿假单胞菌16S rRNA分子生物进化树。

2 结果与分析

2.1 铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测反应结果

为分析铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测方法的特异性与灵敏度，研究对本实验室菌种保藏中心已有的假单胞菌属铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、荧光假单胞菌开展检测分析，结果见图1。由结果可知，铜绿假单胞菌引物探针只对铜绿假单胞菌有特异性扩增曲线，对于阴性对照菌包括恶臭假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌以及荧光假单胞菌未见扩增曲线。这表明本研究建立的实时荧光PCR检测反应体系只对阳性靶标菌铜绿假单胞菌有良好的扩增，对空白对照以及阴性对照菌株均无扩增，可以应用于冷链食品中铜绿假单胞菌的实时荧光PCR检测。

图1 铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测扩增结果Fig. 1 Amplification results of real-time fluorescence PCR detection of Pseudomonas aeruginosa

2.2 铜绿假单胞菌实时荧光PCR检测方法检出限

通过将铜绿假单胞菌菌液稀释检测，最终确定铜绿假单胞菌的方法检出限为1×103CFU·mL-1。

2.3 冷链食品中铜绿假单胞菌的检测

为了验证研究方法的适用性与可操作性，掌握食品特别是冷链食品中铜绿假单胞菌的污染情况，本研究共从超市、农贸市场等地方随机抽取了271 份样品开展铜绿假单胞菌检验工作，结果共检出10 株铜绿假单胞菌，铜绿假单胞菌的总体检出率为3.69% （10/271）。

2.4 方法比对试验结果

研究将3 种铜绿假单胞菌检测方法，包括本研究开发的实时荧光PCR 检测方法、传统的微生物培养方法以及全自动生化仪器鉴别法进行比对，比对结果完全一致，因此可说明本研究方法的可靠性与稳定性。

2.5 铜绿假单胞菌溯源结果以及进化树构建

我们将冷链食品中检测出的10株铜绿假单胞菌（自编号分别为YS-1、YS-2、YS-3、YS-9、YS-36、YS-37、YS-38、YS-39、YS-NL-21、YS-NL-23）进行测序分析，测序结果用于构建生物进化树，以比较假单胞菌属各菌株之间的亲缘关系，具体进化树见图2。

图2 假单胞菌属的分子进化树分析Fig. 2 Molecular phylogenetic tree analysis of Pseudomonas spp.

通过构建生物进化树，可以看出，所有菌株根据在进化树中的分布主要分为3大分支，本实验室分离得到的YS-1、YS-2、YS-3、YS-9、YS-36、YS-37、YS-38、YS-39、YS-NL-21、YS-NL-23 菌株序列与NCBI 数据库中编号为铜绿假单胞菌（NR117678.1）聚类到一支，均为铜绿假单胞菌，与拉尔夸南假单胞菌（NR_179771.1）、古河假单胞菌（NR_179202.1）、博阿南假单胞菌（NR_181770.1）集中分布一支。

通过进化树分析，可以看出本研究分离的铜绿假单胞菌野生菌株与其他单胞菌属菌株的基因同源性大小与亲缘关系的远近，同时也反映出本研究分离的铜绿假单胞菌野生菌株与其他类型单胞菌菌株存在一定程度的变异。因此，可以成功溯源冷链食品中所分离铜绿假单胞菌的种属分类与地位。

3 讨论

随着冷链食品的日益普及，冷链食品所带来的食品安全风险越来越大，但是国内对于冷链食品中病原菌的检测鲜有报道，且未见冷链食品中铜绿假单胞菌的检测数据或者预警分析报告［19-22］。由于铜绿假单胞菌是条件致病菌，对于烧伤或者有创伤病人具有潜在的危害，若不加以控制，很可能会导致术后感染并引发相关并发症［23］。

分子生物学分析手段目前日益普及，对于亲缘关系鉴定以及病原菌的种属定位具有巨大的优势，测序分析可以快速确定病原菌种类并分析不同病原菌之间的相互关系，同时进化树分析可以直观明了地看出各病原菌定位与种属关系。

本研究开展了冷链食品中铜绿假单胞菌的检测与分析，通过冷链食品采样分析与检测，得到冷链食品中铜绿假单胞菌污染数据以及污染水平，对于冷链食品监管以及消费者健康安全有重要的指导作用。

目前，国内对于铜绿假单胞菌从分离、培养到鉴定一般需要5~7 d时间［24-26］。为了缩短检测时间、提高检测效率，本研究将实时荧光PCR检测方法与高通量测序技术相结合，可在18 h 内完成假单胞菌的高通量检测。从市场随机抽样的冷链食品中分离得到了铜绿假单胞菌，通过构建生物进化树分析病原菌的种属及亲缘关系，从基因本质上完成铜绿假单胞菌的种属定位溯源分析，研究结果对于提升食品质量、守护食品安全具有重要意义。通过方法间比对与冷链食品抽样检测，本研究方法稳定可靠，可以广泛应用于冷链食品及相关食品中病原菌的快速筛查检测与病原菌分子溯源分析。未来将继续扩大采样范围以及采样数量，并将方法进一步应用于更多不同种类的食品检测中。