用于樱桃番茄保鲜的纳米银复合膜材料研究与应用

张朝涛，王春慧，高光晔，石洪玮，李雪，刘贵巧 ，毛雪飞

1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056038；2.中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业农村部农产品质量安全重点实验室，北京 100081；3.珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司，北京 100015

樱桃番茄是一种营养丰富的农产品［1］，备受消费者喜爱。然而，由于脱水、褐变和腐败微生物的繁殖，樱桃番茄的货架期相对较短，且品质和风味容易在贮藏过程中损失。为了延长樱桃番茄的货架期，有研究采用天然蜡质涂层对水果和蔬菜进行保鲜处理，但是结果显示该方法不足以防止贮藏过程中重量和水分的损失［2］，因此亟需开发更为有效、可靠的可食用涂层和薄膜。壳聚糖（CTS）作为涂膜保鲜剂显示出了良好的应用潜力，其在果蔬表面形成一层薄膜，可以有效隔绝果实与外界空气的直接接触，减弱果实的呼吸强度，在一定程度上延缓果实腐烂及衰败［3］，但单一的CTS 涂膜无论在材料性能还是抑菌性方面仍存在一定缺陷。

近年来，纳米材料吸引了越来越多的关注，其中AgNPs 因其优良的广谱杀菌性能而被广泛应用［4］。有研究发现，将AgNPs 和壳聚糖等天然高分子物质结合用于果蔬保鲜，亦可延缓果蔬腐烂和衰败，对贮藏期间保持果蔬品质起到了积极作用［5-8］，在果蔬保鲜领域有巨大的应用潜力［9-10］。目前，对于AgNPs的合成方法主要有物理法、化学法和生物还原法，其中物理法往往对仪器设备要求较高，能耗大［11］；而化学法在使用化学试剂的同时也会产生一些有害副产物，对环境造成威胁［12］。因此，研究绿色环保、低成本、反应温和的合成方法是AgNPs 应用的重要方向［2］。已有研究用茶叶［13］、芒果皮［14］、芦荟叶［11］等组织提取物来制备AgNPs，进行抑菌活性测试，并取得了良好的抑菌和保鲜效果。药理学研究显示，菊花中含有的维生素、黄酮类、菊甙等物质使其具有抗氧化、抑菌消毒、保护心血管系统、抗癌以及促进胆固醇代谢等功效［15］，这些物质亦可以充当天然的还原剂。因此，本研究利用菊花提取物绿色合成银纳米粒子并与壳聚糖涂膜混合用于樱桃番茄保鲜，监测在该复合膜下贮藏期间樱桃番茄保鲜品质的变化，以期为果蔬保鲜提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

樱桃番茄、菊花茶购自北京超市；壳聚糖（脱乙酰度≥95%）购自麦克林生化科技有限公司；二水合草酸、氢氧化钠、酚酞、抗坏血酸、2，6-二氯靛酚钠盐、硝酸银等化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；50 nm AuNPs 悬浮液（1 mmol·L-1柠檬酸水溶液为介质）购自美国Nano Composix公司；金、银元素标准储备液（1 000 mg·kg-1）购自国家有色金属及电子材料分析中心。

18.2 MΩ 超纯水仪购自美国MillI-Q 公司；ES35 B-Pro磁力搅拌器购自LabTech公司；电热恒温水浴锅购自上海助蓝仪器科技有限公司；KQ3200DE 型数控超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；pH 计购自梅特勒托利多集团；TGL-15B 离心机购自上海安亭科学仪器厂；Nex-ION®5000 三重四极杆电感耦合等离子质谱仪购自美国PerkinElmer 公司；Lambda 1050+紫外可见分光光度计购自美国PerkinElmer公司。

1.2 AgNPs材料的合成与表征

1.2.1 菊花提取物的制备和AgNPs 粒子的合成本文参照Li 等［14］的绿色合成方法略有改动，利用菊花提取液绿色合成AgNPs。分别称取1 g 菊花茶浸泡于40 mL去离子水中，90 ℃下水浴30 min，提取干菊花茶中的活性成分，待菊花茶浸取液冷却后，用0.45 μm 滤膜过滤。按菊花茶叶浸取液和1 mmol·L-1的AgNO3溶液体积比为1∶50，将菊花茶浸取液逐滴加到AgNO3溶液中，反应温度80 ℃，磁力搅拌器反应1 h，合成AgNPs。

1.2.2 紫外-可见分光光度计分析 使用紫外-可见光分光光度计进行AgNPs 的初步测定，光谱在波长250~800 nm范围内进行扫描。

1.2.3 单颗粒电感耦合等离子质谱分析 传输效率（transfer efficiency，TE）的测定以50 nm AuNPs进行，用超纯水稀释至9.89×104粒子·mL-1，母液超声15 min，之后每次逐渐稀释超声3 min，以重新分散团聚颗粒。金、银元素标准溶液校准曲线浓度分别为0、1、2、5和10 μg·L-1。

1.2.4 透射电子显微镜测试 将AgNPs溶液进行30 min超声处理，然后滴加在铜网上（3 mm，300目），室温条件下干燥。最后在200 kV 的加速电压下对样品进行分析。

1.3 合成AgNPs的抑真菌性能

参照开凯等［16］使用的方法对病原菌进行分离和纯化，在超净工作台内将樱桃番茄病斑位置周围用酒精进行表面消毒，切除组织二次消毒后用无菌水清洗干燥，将其病斑组织接种至PDA 平板上，于25 ℃下培养3 d，重复直至得到纯化菌株，用于后续试验。通过记录其菌落、菌丝、孢子的形态特征，依照真菌形态学鉴定手册对其进行判定。

采用菌丝生长速率法［17］，测定所合成AgNPs的抑菌活性。具体为：等灭菌后的PDA 培养基温度下降后将AgNPs（用前超声15 min）分别稀释至1.0、2.5、5.0、10.0 mg·L-1。取培养3 d的5 mm直径的菌饼，将其轻放于含上述已配置好的不同浓度AgNPs的培养基平板中（有菌丝的一面朝下）。以不添加任何物质的PDA 平板作为空白对照，放入25 ℃培养箱中培养，每个处理重复3次。3 d后用十字交叉法测量病原菌的直径，计算菌丝生长抑菌率，并根据不同浓度的AgNPs 与其抑菌率结果来拟合毒力回归方程。按公式（1）计算抑菌率。

1.4 AgNPs-CTS复合膜的制备及表征

1.4.1 AgNPs-CTS 复合膜的制备 50 mL 水中加入0.5 g壳聚糖和0.5 mL 1%乙酸，随后加入一定量的AgNPs 搅拌均匀得到AgNPs 浓度为10 mg·L-1的复合涂膜液。取干净培养皿，向上铺一层保鲜膜尽量保持平整无皱，倒入适当膜液，置于60 ℃烘箱烘干。

1.4.2 AgNPs-CTS 复合涂膜的傅里叶红外光谱测试 波数范围600~4 000 cm-1，直接扫描测定。

1.4.3 AgNPs复合涂膜扫描电镜表征 烘干平板膜水分，用导电胶固定在样品底座上，表面喷金后，用扫描电镜观察复合膜表面形貌。

1.5 樱桃番茄的表面消毒及涂膜处理

使用70%的酒精对樱桃番茄进行表面消毒，以除去樱桃番茄表面的污染物，如灰尘和污垢，随后用蒸馏水洗涤。自然风干后，将樱桃番茄随机分成3 组，浸入不同涂膜溶液中2 min，取出自然风干以便在水果表面形成薄涂层，将果实保存在室温下储藏观察。空白组用蒸馏水处理，试验重复3次。

1.6 AgNPs-CTS 复合膜对樱桃番茄保鲜作用的研究

1.6.1 果实腐烂率 分别于涂膜0、3、6、9、12、15 d记录果实表面的腐烂情况。

1.6.2 失重率 采用称重法［18］，每3 天称量各组樱桃番茄质量，测定3个重复，取平均值。

1.6.3 果肉可溶性固形物测定 采用手持折光仪进行测定。称取5 g样品于研钵中磨碎，用纱布过滤后吸取汁液用折光仪直接读数，结果用质量分数（%）表示。

1.6.4 果肉可滴定酸含量 可滴定酸采用滴定法进行测定［19］。

1.6.5 维生素C 采用2，6-二氯靛酚滴定法测定抗坏血酸（vitamin C，Vc）含量［20］。称取5 g样品和5 mL 20 g·L-12%草酸溶液于研钵中磨浆，定容至50 mL容量瓶，过滤后取10 mL用标定过的2，6-二氯靛酚溶液滴定至粉红色，且30 s 不褪色，计算Vc的含量。

2 结果与分析

2.1 合成AgNPs的表征

AgNPs 的绿色合成使用菊花茶提取物进行，加入AgNO3反应一段时间后显示其颜色从无色变为棕色（图1A），初步反映了AgNPs 颗粒的合成。使用UV-Vis光谱进一步表征处理过的合成液（图1B），观察到在435 nm 处有吸收峰，这是银纳米粒子的典型吸收峰，所得结果与使用茶叶提取物合成的AgNPs 结果一致［23］。然后利用SP-ICP-MS 技术测定了所合成AgNPs的尺寸大小与粒径分布（图1C），计算得出AgNPs 的平均分布粒径大小为27.8±1.1 nm。透射电镜分析结果也证实了球形或类球形的AgNPs 具有良好的分散性，据统计AgNPs 的平均粒径在20~30 nm，尺寸分布均匀，该结果与上述SP-ICP-MS的测试结果一致。

图1 AgNPs的绿色合成及其表征Fig. 1 Green synthesis and characterization of AgNPs

2.2 AgNPs的抑菌性能测试

对病原菌经过分离纯化后，PDA 平板生长菌落的菌丝发达呈致密的绒毛状，初期为灰白色，后期变为青褐色（图2A），通过显微镜观察的孢子形态如图2B所示，依据真菌形态学鉴定手册中相关描述［21］，并结合菌落特征［22］，初步鉴定该真菌为交链孢菌。交链孢霉菌属是导致番茄采后病害的主要病原菌，腐烂的番茄不仅造成巨大的经济损失，而且会在其腐烂部位及周围健康组织中积累大量的真菌毒素［23］。

图2 从樱桃番茄上分离纯化得到的交链孢霉菌显微镜图Fig. 2 Microscopy of Streptomyces alternaris isolated andpurified from cherry tomatoes

为此，本研究以交链孢霉菌为对象，采用菌丝生长速率法来考察所合成AgNPs对该病原真菌的抑制效果。由图3 可知，与对照组相比，AgNPs 对交链孢霉菌有显著的抑制效果。AgNPs的抑菌率与其浓度成正比，浓度越大，抑菌效果越好，10 mg·L-1的AgNPs 抑菌率达到79%，10.0、5.0、2.5、1.0 mg·L-1的AgNPs 对交链孢霉菌的抑制效果分别为79%、62%、48%和34%。半数效应浓度EC50是衡量物质对生物系统产生效应的重要指标［24］，由表1 可知，所合成AgNPs 对交链孢霉菌的EC50为2.466 mg·L-1，毒力回归方程的回归系数R2大于0.9，表明曲线与实际拟合程度较好。

表1 毒力回归方程的建立及其EC50Table 1 Establishment of virulence regression equation and its EC50

图3 不同浓度的AgNPs对交链孢霉菌生长的影响Fig. 3 Effects of AgNPs at different concentrations on the growth of Streptomyces alternans

2.3 两种涂膜的傅里叶红外光谱表征

图4 为CTS、AgNPs-CTS 2 种涂膜的红外图谱。可以看出，3 195.8 cm-1处的宽峰为-OH和-NH2的伸缩振动峰重叠形成，2 927.2 cm-1处双峰是-CH3和-CH2的伸缩振动峰［25］。两种涂膜材料红外光谱图相似，由此判断，简单的物理混合使AgNPs与壳聚糖分子间并未形成化学键，相互作用较弱。

图4 两种涂膜红外光谱图Fig. 4 Infrared spectra of the two coatings

图5 为CTS 及AgNPs-CTS 两种涂膜的扫描电镜图，结果显示壳聚糖膜表面相对光滑平整，上有小孔，可见壳聚糖优良的成膜特性。而添加了AgNPs的复合涂膜组则能明显看到均匀分布的小颗粒以及少量体积较大的颗粒，为AgNPs 在复合涂膜上的不规则团聚导致。将AgNPs添加在壳聚糖涂膜液中，可观察到在一定程度上降低了气体的透过率，增加了它的阻隔性能，可在水果保鲜上起到一定的积极效果。

图5 膜表面扫描电镜图(×8 000）Fig. 5 Scanning electron microscopy of the membrane surface (×8 000)

2.4 AgNPs-CTS 复合膜对樱桃番茄保鲜品质的影响

2.4.1 果实失重率在贮藏期间的变化 两种涂膜

处理对樱桃番茄贮藏期间失重率的影响结果由图6 可知，各组樱桃番茄的失重率随着贮藏时间的延长而呈现不断增加的趋势。第6 天后，复合膜处理组失重率低于空白组。贮藏15 d后空白组的失重率达到9.83%，而涂膜组的失重率显著小于空白组（P<0.05），其中CTS组的失重率为8.71%，AgNPs-CTS 组的失重率为7.73%。这是由于表面添加AgNPs 的壳聚糖涂膜增加了阻隔性，从而对果实中水分进行阻挡，在一定程度上降低了樱桃番茄的失重率，复合涂膜的透射电镜表面表征图也验证了这一结果。

图6 不同涂膜处理对樱桃番茄果实失重率的影响Fig. 6 Effect of different coating treatments on the weight loss rate of cherry tomato fruits

2.4.2 果实腐烂率在贮藏期间的变化 图7 为各组樱桃番茄腐烂率随贮藏时间的变化，结果可知3 组处理的腐烂率均随贮藏时间的延长呈现增大的趋势，经过15 d 的贮藏后空白组的腐烂率达到了60%，而CTS 和AgNPs-CTS 2 个涂膜组的腐烂率控制在30%以下，分别为25%和20%。图8A为樱桃番茄浸过不同涂膜液处理后第15 天的腐烂情况，可知相较于空白组及CTS 涂膜组来说，AgNPs-CTS 涂膜组发霉腐烂程度较轻，只出现腐烂面积小于10%的小点。这一结果验证了所合成的AgNPs 具有良好的抑真菌性能；图8B 显示3组完好的樱桃番茄中空白组及CTS涂膜组均出现不同程度的褶皱和腐败，而AgNPs-CTS 涂膜组腐败程度较轻。另一方面经涂膜处理后，尤其是复合涂膜处理后良好的阻隔性，提高了对各种气体分子以及微生物的穿透阻力，抑制了果实的呼吸代谢，从而使其组织衰老进度减缓。

图7 不同涂膜处理对樱桃番茄果实腐烂率的影响Fig. 7 Effects of different coating treatments on fruit decay rate of cherry tomatoes

图8 不同涂膜液处理下樱桃番茄腐烂状况Fig. 8 Decay of cherry tomatoes treated with different film solutions

2.4.3 果肉可溶性固形物在贮藏期间的变化 可溶性固形物含量的变化趋势如图9所示，3组处理的整体变化趋势呈现先升高后降低的趋势，这与江爱莲等［1］的研究结果一致。原因是一方面果实在后熟阶段进行多糖等高分子物质的分解转化，另一方面随着贮藏时间的变化进行呼吸代谢消耗。由图9可知，在第3天3组的可溶性固形物含量快速降低，这是由于果实内部一些多糖物质水解所致［26］，在第6 天后缓慢波动降低，对照组可溶性固形物含量比2 个涂膜组下降快，而AgNPs-CTS组可溶性固形物含量则相对稳定，在整个贮藏后期含量变化波动较小，在15 d 时可溶性固形物的含量明显高于其他2 组（P<0.05）。结果表明空白组以及CTS 涂膜组呼吸作用相对较强，果实中的糖被快速消耗，而复合膜能有效与外界阻隔，降低呼吸效率，从而缓解了可溶性固形物的消耗。

图9 不同涂膜处理对樱桃番茄果实可溶性固形物含量的影响Fig. 9 Effect of different coating treatments on soluble solids content of cherry tomato fruits

2.4.4 果肉可滴定酸在贮藏期间的变化 图10为不同涂膜处理组可滴定酸含量的变化，可以看出各组可滴定酸含量随着贮藏时间的延长和果实的成熟衰老，有机酸含量整体呈现缓慢降低的趋势，这一变化趋势与李琴琴［27］、王鑫等［28］的研究结果一致。经过15 d贮藏后，AgNPs-CTS复合涂膜处理组可滴定酸含量显著高于其他两个处理组（P<0.05），樱桃番茄中的可滴定酸含量为0.23%，分别较空白组高了3.4%，较CTS 涂膜组高了1.8%。这说明经涂膜处理后樱桃番茄贮藏期间生理活动受到了抑制，可滴定酸消耗速率降低从而使其能维持稳定，而添加AgNPs组相较于其他处理组可滴定酸含量的波动较小。

图10 不同涂膜处理对樱桃番茄果实可滴定酸含量的影响Fig. 10 Effect of different coating treatments on titratable acid content of cherry tomato fruits

2.4.5 果肉Vc 含量在贮藏期间的变化 Vc 不仅是樱桃番茄中重要的营养物质，其较强的抗氧化活性与果实的抗逆性和抗衰老能力密切相关，空白组中Vc 含量的快速下降与其较高的腐烂率是相符的。不同涂膜处理对樱桃番茄Vc 含量的影响如图11 所示，在贮藏期间，茶叶纳米银处理组Vc含量显著高于其他2个处理组（P<0.05），AgNPs-CTS组樱桃番茄中Vc 含量为35.30 mg·100 g-1，分别较空白组和CTS 涂膜组高了9.5%和4.3%。由此可知，AgNPs-CTS复合涂膜处理后可以有效缓解樱桃番茄贮藏过程中的营养物质消耗。

图11 不同涂膜处理对樱桃番茄果实维生素C含量的影响Fig. 11 Effect of different coating treatments on vitamin C content of cherry tomato fruits

3 讨论

本文以菊花提取液绿色合成了AgNPs，研究了其抑制交链孢霉菌的性能。通过制备AgNPs和壳聚糖的复合涂膜，考察了不同涂膜液在樱桃番茄保鲜中的应用效果。结果显示，使用菊花提取物绿色合成的AgNPs呈球形，具有良好的分散性，对交链孢霉菌有良好的抑菌效果。在CTS涂膜液中加入10 mg·L-1AgNPs 可以提高其阻隔性，经15 d的贮藏后，樱桃番茄的可溶性固形物含量、可滴定酸含量、Vc 含量较其他2 组可以维持在一个较高的水平，对樱桃番茄的腐烂率和失重率有明显的缓解效果。

使用生物系统中存在的天然还原剂，与物理化学方法相比减少了对有毒化学物质的接触是环境友好的，因此纳米颗粒的绿色合成方法备受青睐。例如，Logambal 等［29］利用药用植物炮弹果花瓣提取物成功进行了环境友好的银纳米颗粒合成，证实了合成的银纳米颗粒具有显著的抗菌效果；Nava等［30］利用罗勒水提物生物合成AgNPs，发现其延缓了西葫芦中黄瓜花叶病毒病害症状的发展，并增加了总可溶性碳水化合物、自由基清除活性、抗氧化酶以及总酚和类黄酮含量。本文利用菊花茶叶绿色合成AgNPs 的方法简单、成本低且绿色无污染，合成中不需加任何表面活性剂就可得到分散性较好的AgNPs，亦具有良好抑菌性能。这表明绿色合成纳米银在果蔬采后抑菌中具有很好的应用前景。

近几年来，AgNPs 作为一种食品抗菌包装材料被广泛应用于食品保鲜中。Sun 等［31］以猕猴桃皮提取物生物还原银纳米粒子，制备了具有优异抗氧化和抗菌活性的海藻酸钠（sodium alginate，SA）基薄膜，复合薄膜展现出显著增强的抗氧化性能，以及对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性有明显提高，可有效保持樱桃在25 ℃贮藏期间的新鲜度。AgNPs复合涂膜在鲜切工业中也具有潜在的应用价值，Ortiz 等［6］将AgNPs 与壳聚糖结合作为可食性涂层应用到鲜切甜瓜上，与未涂覆的样品相比，涂膜处理降低了鲜切甜瓜的呼吸强度。此外，具有涂膜后的鲜切水果具有更好的感官质量，银的引入导致储存后期嗜温性降低，在5 ℃下13 d后表现出更低的半透明性和质地/硬度退化，防止在后期储存期间的软化，且可以延长鲜切甜瓜的货架期。本试验通过将所合成的纳米银与壳聚糖复合成膜，在一定程度上增加了复合膜的阻隔性能，结果表明该复合涂膜组保鲜性能显著优于CTS 组和空白组，在贮藏15 d 后，AgNPs-CTS 涂膜可维持樱桃番茄较好的营养品质，并能显著降低其腐烂率和失重率，对于果蔬采后保鲜有积极效果。

总的来说，利用菊花茶等绿色合成AgNPs 的方法相较于传统合成方法操作更简单、成本更低、更安全，具有较好的应用前景。与壳聚糖复合成膜后应用可进一步提高樱桃番茄采后的质量、安全性和经济价值。该研究为进一步深入研究纳米银的抗菌机制、保鲜机制等相关研究奠定了基础，为纳米银复合保鲜涂膜的开发和利用提供了可靠的基础数据支持。