一种基于定量PCR 的CRISPR/Cas9 基因编辑作物快速检测方法的研究

张笑天，王智，朱鹏宇，魏霜，付伟，黄春蒙，李志红，王慧煜，焦悦

1.中国农业大学植物保护学院，北京 100193；

2.中国检验检疫科学研究院，北京 100176；

3.广州海关技术中心，广州 510623；

4.农业农村部科技发展中心，北京 100122

基因编辑技术是采用位点特异性核酸酶剪切DNA，造成靶位点产生双链DNA断裂（double strand breaks，DSB），从而诱导细胞对DSB进行非同源末端修复（non-homologous end joining，NHEJ）或同源重组（homologous recombination，HR），利用修复过程中的误差而使基因组发生突变的技术［1］。突变类型包括单核苷酸或多核苷酸的插入、缺失、替换等。目前，以RNA 介导的成簇规则间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）关联蛋白（CRISPR-associated protein）［2］作为基因组编辑工具占据较高比例。其中，由Cas9 核酸酶和单向导RNA（single guide RNA，sgRNA）构成的CRISPR/Cas9 系统是较为常用的基因编辑系统。自基因编辑技术出现以来，大量由基因编辑技术定点修饰基因组所得的新性状作物不断出现，如强耐旱性玉米［3］、高油酸低亚油酸大豆［4-5］、高花青素含量的紫番茄［6］、抗除草剂水稻［7-9］等，这其中离不开对基因编辑产品的有效检测，从而判断基因编辑产品的成功与否。

对基因编辑产品的有效检测方法是基因编辑产品研发与监管的基础，而基因编辑由于无外源基因插入，其与亲本的差异多为靶位点处的单碱基或多碱基的插入、缺失、替换以及以上3 种类型的混合发生。常规的转基因产品检测方法与策略并不适用于这类产品的检测，因此对基因编辑产品检测方法的研究具有重要意义。为了对基因编辑产品进行有效检测，研究者们提出了许多方法，如以T7 内切酶1（T7E1）、Surveyor 核酸酶为主流的错配酶切割法（enzyme mismatch cleavage，EMC）［10］和高分辨率溶解曲线法（high resolution metting analysis，HRMA）［11］；许文涛教授团队开发的基于快速多重连接酶扩增反应（multiplex ligation probe amplification，MLPA）的基因编辑猪检测方法与横向流动核酸生物传感器（lateral flow nucleic acid biosensor，LFNAB）相结合，取得了良好的检测效果［12］。寡核糖核酸（oligoribonucleotide，ORN）探针对相应序列有一定的封闭作用，Fujita等［13］基于此开发了一种寡核糖核酸干扰的PCR（ORNi-PCR）对编辑THYN1基因的细胞进行灵敏度检测，发现最低可检测到1个碱基的突变；Takeshi等［14］同时使用3 条引物结合毛细管电泳开发了一种简单的基于PCR 的竞争性PCR，从而实现了对基因编辑细胞的检测。除以上方法外，实时荧光定量PCR 是转基因检测较为常用的方法，研究人员也开发了一种基于Taqman探针法的双探针，通过在编辑位点及其附近区域设计不同荧光标记探针对基因编辑产品进行检测，该方法已证明可应用于多种作物的检测，灵敏度高且能检测到单碱基突变［15］。以上方法中，EMC、基于竞争式或封闭式PCR、以及MLPA 的检测方法均操作简单，其中EMC 敏感度较低无法检测单碱基突变［16-17］，其余方法均需二次操作才可得到结果，HRMA 具有高通量特点，但对于大片段缺失的检测具有一定局限性［18］。相比来看，实时荧光PCR 无需二次操作且能实现对基因编辑产品的高灵敏特异性鉴定，具有广泛的应用前景。

本研究在靶位点处设计1 条Taqman 引物探针，并在其两侧设计引物，使用水稻PLD基因作为内参基因，对编辑Os11N3基因的水稻进行检测，结合本实验室研发的植物基因组直提试剂盒，建立了一种基因编辑水稻位点特异性检测方法，以期为基因编辑产品的检测和监管提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻Os11N3（OsSWEET14）基因在根、茎、叶中均有表达，抑制其表达可使水稻对水稻白叶枯黄单胞菌Xoo（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）产生抗性［18］。利用CRISPR/Cas9 基因编辑技术对日本晴水稻的Os11N3基因进行了编辑，选取其中突变体19OSH-24、19OSH-32、19OSH-110、19OSH-105作为实验材料。

为验证本方法对单碱基突变的检测能力，研究还合成了9 种不同序列的质粒作为实验材料，模拟不同单碱基的突变情况。

1.2 DNA的提取

取约2 cm 的新鲜水稻叶片放入2 mL 离心管中研磨仪1 500 r·min-1，1 min 研磨2 次后，使用3 种不同方法提取水稻叶片基因组，每种提取方法重复3次。

1.2.1 CTAB 法提取水稻叶片基因组 水稻叶片基因组参照参考文献中的CTAB 法［19-20］并进行了改动，首先配制2% CTAB 缓冲液（1 L）：20 g CTAB、81.82 g NaCl 加无菌水充分溶解后加入0.5 mol·L-1EDTA-Na240 mL、1 mol·L-1Tris-HCl 20 mL。向研磨好的水稻叶片中加入700 μL 2%CTAB缓冲液，蛋白酶K 4 μL，水浴20 min后加入等体积氯仿抽提，取上清液使用预冷的无水乙醇沉淀20 min，弃上清后75%乙醇清洗2次并晾干，最后加入80 μL ddH2O 溶解，并使用Nanodrop 1 000 对其浓度（ng·μL-1）、A260/A280、A260/A230进行测定。

1.2.2 试剂盒法提取水稻叶片基因组 水稻叶片基因组提取参照天根植物基因组提取试剂盒（DP305）说明书进行提取，并使用Nanodrop 1 000对其浓度（ng·μL-1）、A260/A280、A260/A230进行测定。

1.2.3 植物基因组直接提取试剂盒提取水稻叶片基因组 使用本实验室研发的植物基因组直提试剂盒。向研磨好的水稻样品中加入120 μL 提取液，95 ℃金属浴15 min，离心后取上清5 μL，加入ddH2O稀释10倍后使用［21］，并使用Nanodrop 1 000对其浓度（ng·μL-1）、A260/A280、A260/A230进行测定。

1.3 qPCR扩增

反应体系（总体积20 μL）为：2×Taqman Gene Expression Master Mix 10 μL，正、反向引物（10 μmol·L-1）各1 μL，模板（植物基因组40 ng）1 μL，ddH2O 补齐至20 μL。qPCR 使用ABI 7500 Fast 实时荧光定量PCR仪完成，扩增程序为：94 ℃预变性15 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸30 s，共40个循环。

1.4 引物探针设计筛选

研究选取水稻PLD基因作为内参基因，使用标准SN/T 1204-2016中PLD基因引物探针进行扩增，靶位点序列及探针设计位置如图1 所示，在靶位点上下游设计多对通用引物，并于sgRNA 和PAM 序列前后20 bp 左右设计多条探针进行筛选。最终使用引物探针序列见表1。

表1 荧光定量PCR所用引物探针Table 1 Primers and probes used in fluorescent quantitative PCR

图1 靶位点探针设计位置Fig. 1 Position of the target site probe

1.5 特异性验证

为验证检测方法的特异性，选取突变体19OSH-24、19OSH-32、19OSH-110、19OSH-105以及日本晴作为模板进行扩增。

1.6 灵敏度验证

使用pUC57 为骨架合成质粒对该方法能否检测到单碱基突变进行验证，合成质粒图谱及序列见图2。

图2 质粒图谱及插入序列Fig. 2 Plasmid map and insertion sequence

2 结果与分析

2.1 3种基因组提取方法对比

研究比较了CTAB 法、天根试剂盒法和植物基因组直提试剂盒法（以下简称直提法）对水稻叶片基因组进行提取的效果。结果发现，与CTAB法相比，直提法所得基因组浓度、质量及基因组的量均低于CTAB 法；与试剂盒法相比，直提法提取基因组浓度较高，基因组的量也较多，但质量较低。

由表2 可知，CTAB 法所得基因组A260/A280在1.9~2.0 之间，基因组纯度较高；天根试剂盒法所得基因组A260/A280低于1.8，在1.52~1.54 之间，所得基因组纯度略低，而直提试剂盒法所得基因组A260/A280最高0.85，远低于1.8，基因组纯度较低。3种提取方法中直提法所得基因组A260/A230小于1，提示其污染比较严重。结合基因组浓度，CTAB法所得基因组浓度、质量最好，天根试剂盒法基因组浓度最低、质量居中，直提法基因组浓度居中，质量最低。

表2 3种基因组提取方法耗时、浓度、质量Table 2 Time-consuming, concentration and quality of three genome extraction methods

直提法所得基因组虽然在浓度和质量上各有不足，但其操作简单，缩短了提取所需的时间，整个过程只需35 min，且通过PLD扩增曲线可以看出（图3），直提法提取基因组的质量和基因组浓度均可满足检测需要，所以直提法在快速通关等实际场景中具有应用价值。

2.2 特异性评价

为验证检测体系的特异性，选取了突变体19OSH-24、19OSH-32、19OSH-110、19OSH-105，并用亲本日本晴水稻作为对照进行检测。实验结果如图4所示，4个突变体和亲本日本晴内参基因PLD均扩增良好，在靶位点处只有未编辑过的野生型得到了有效扩增，与图5中的测序结果一致。这说明本研究所建立的检测方法具有一定的特异性。

图4 特异性评价荧光扩增曲线Fig. 4 Fluorescence amplification curve of specific evaluation

图5 水稻基因组测序结果Fig. 5 Sequencing results of rice genome

2.3 灵敏度评价

CRISPR/Cas9 系统编辑所产生的突变具有随机性和不确定性。为验证本研究所建立方法是否能够有效区分单碱基突变与未经编辑的野生型，研究设计了图2所示的9种不同质粒，其中一种质粒所含序列为野生型靶点片断和PLD片断，其余质粒含有与靶位点存在1个碱基差异的片断和PLD片断。实验结果如图6所示，虽然突变体质粒有少量的扩增但仍与WT扩增曲线有明显区别，突变体质粒相对表达量为0.001~0.123 5，表明本研究创建的体系能够有效区分单碱基突变与野生型。

图6 灵敏度评价荧光扩增曲线Fig. 6 Fluorescence amplification curve of sensitivity evaluation

3 讨论

本研究建立了一种基于qPCR 对基因编辑水稻的检测体系。首先，该体系与EMC、双探针法、封闭性PCR、竞争性PCR、HRMA 等均有良好特异性，能够将基因编辑产品与其亲本进行明显区分。其次，本研究所建立的方法具有较高灵敏度，目前主流基因编辑检测方法EMC 可对较长片段的插入、缺失进行检测，与之相比，本体系可将单个核苷酸的插入、缺失、替换与亲本野生型进行区分［16，22］，具有良好的灵敏度，且减少了检测中假阴性出现的概率。在检测大片段缺失方面，本体系内参基因选择了水稻PLD基因，避免了大片段缺失造成双探针法［15］无法检测到内参基因而影响判断的问题，弥补了HRMA 对100 bp 以上缺失检测的局限性［17］。同时，本方法也可通过使用384 孔板达到HRMA 高通量检测的目的。在操作时间与流程上，与基于封闭性PCR［13］和竞争性PCR［14］相比，本体系只需要对提取的基因组进行qPCR，通过Ct值和荧光曲线即可判断编辑位点是否发生突变，不需要对PCR 产物进行毛细管电泳或琼脂糖凝胶电泳等二次处理，一定程度上节省了成本和时间。此外，在基因组的提取上，采用本实验室自行研发的植物基因组直接提取试剂盒，缩短了基因组提取所需时间，所得基因组虽然在提取质量和浓度上与CTAB 法相比有一定差距，但完全可以满足检测需要，且大大节约了时间。综上，本研究所建立的针对水稻Os11N3靶位点的检测方法特异性强，可同时区分到1个碱基的突变，操作简单，可行性强，具有耗时短、成本低的特点，在条件不同的各实验室内均可开展，在基因编辑产品育种过程筛选以及基因编辑产品的定性检测中具有一定的推广应用价值。