pH 渐变条件下多酶分步连续酶解工艺制备鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽

王珍瑜，陆文超，钟康荣，关永健，汪真，陈超

1.清华大学化学系，北京 100084；2.贵州千鲟生物科技有限公司，贵州 黔东南苗族侗族自治州 556300

鲟鱼，又名鲟龙，隶属于硬骨鱼纲辐鳍亚纲硬鳞总目鲟形目，是地球上最原始和最古老的软骨鱼种之一，也是淡水鱼中寿命最长、个体最大的鱼类［1］。近年来，我国开展了鲟鱼养殖，目前，我国已成为世界鲟鱼养殖第一大国，其中史氏鲟（Acipenser schrencki）养殖年产量已达2.5 万t。其头、脊索、鳍中软骨占鱼体质量的10%左右。鲟鱼软骨中含有丰富的硫酸软骨素和胶原蛋白，具有很高的营养价值和较强的保健功能，素有“鲨鱼翅、鲟鱼骨，食之明目壮阳，延年益寿”之说［2-3］。

硫酸软骨素（chondroitin sulfate，CS）是一种酸性粘多糖，结构复杂，主要以与蛋白质结合的蛋白聚糖形式存在［4-5］。硫酸软骨素作为一种天然的活性成分在医药领域有着广泛的应用前景［6-7］，探索并开发硫酸软骨素具有重要的经济与社会价值［8-10］。

硫酸软骨素的提取方法有碱盐法、碱法、超声波法、乙酸抽提法和酶解法等［11-12］。常用的硫酸软骨素提取方法一般需要使用大量的碱液和有机溶剂，提取率相对也比较低。Ⅱ型胶原蛋白是鲟鱼软骨中的主要蛋白，其由3个分子量约为110 kD的α链组成。鲟鱼软骨中的胶原蛋白也具有一定的营养价值，但由于其分子量太大且具有三螺旋结构，不易被快速消化吸收，其功效与价值很难被利用。然而，胶原蛋白水解成小分子量肽之后，消化吸收率会得到明显提高［13］。近年来，研究者也加大了对胶原蛋白肽的提取、分离、纯化工艺的研究［14-16］，进而对其生理作用进行探究［17-18］。

本研究在pH 渐变条件下用多酶连续分步酶解工艺，采用单因素试验法考察了酶用量、酶解时间、酶解温度3 个因素对酶解效果的影响。酶解后利用超滤分离即可得到纯度较高的硫酸软骨素和胶原蛋白肽，期望为今后用鲟鱼软骨生产硫酸软骨素和胶原蛋白肽提供了工艺依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

冷冻鲟鱼段由贵州省千鲟生物科技有限公司提供；木瓜蛋白酶240 U·mg-1、碱性蛋白酶100 U·mg-1、菠萝蛋白酶100 U·mg-1均购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司；硫酸软骨素标准品购自上海阿拉丁生化科技有限公司；盐酸氨基葡萄糖对照品购自Sigma 公司；对二甲氨基苯甲醛、乙酰丙酮、碳酸钠、苯酚等试剂皆为分析纯。

岛津LC-16 液相色谱仪；PL203 型电子天平（梅特勒-托利仪器（上海）有限公司）；岛津UV-2600i 紫外分光光度计；TYM-8 电热恒温水浴锅（中国济南天宇专用设备有限公司）；高速粉碎机（TP-1000C-8，宁波新芝生物科技股份有限公司）；台式高速冷冻离心机（TGL-16M，长沙易达仪器有限公司）；真空冷冻干燥机（FD-5，上海能共实业有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 材料的预处理 鲟鱼段解冻后，去肉，取出头部、脊索、鳍软骨，投入80~100 ℃水中烫浸5~10 min，取出冷却至40 ℃以下，剔除头部、脊索软骨上残留的肌肉、脂肪和其他结缔组织，用绞肉机绞碎，放入水中搅拌，然后过筛清洗，以除去碎肉和脂肪，沥干水分后备用。

1.2.2 酶解法提取硫酸软骨素与胶原蛋白肽 鲟鱼软骨称重，加软骨5 倍重量的去离子水，用胶体磨磨成浆状，升温至100 ℃，保持20~30 min，降温至25 ℃，加碳酸钠调pH 至8.5。先加入碱性蛋白酶，控温酶解一段时间（按单因素实验梯度设置进行）后，再加入木瓜蛋白酶，控温酶解一段时间（按单因素实验梯度设置进行），然后加入菠萝蛋白酶，控温酶解一段时间（按单因素实验梯度设置进行）后，升温至90~95 ℃灭活，保持20~30 min，降温至40 ℃以下，过滤，滤液用截留分子量10 000 Da的中空纤维膜超滤，截留部分冷冻干燥后得到鲟鱼硫酸软骨素，透过液冷冻干燥后得到胶原蛋白肽。按照式（1）计算提取率。

式中，Y为提取率，C1为产物中目标物的含量，C0为原料中目标物的含量，W1为产物质量，W0为原料质量。

1.2.3 单因素实验实验条件和梯度范围 对酶解

温度、酶解时间和酶用量分别进行单因素实验，碱性蛋白酶酶解温度选取6 个水平（35、40、45、50、55、60 ℃）；碱性蛋白酶酶解时间选取6 个水平（1、2、3、4、5、6 h）；碱性蛋白酶酶用量选取6 个水平（25、50、100、200、300、400 U·g-1）；木瓜蛋白酶酶解温度选取6个水平（35、40、45、50、55、60 ℃）；木瓜蛋白酶酶解时间选取6个水平（1、2、3、4、5、6 h）；木瓜蛋白酶酶用量选取6 个水平（30、40、50、60、70、80 U·g-1）；菠萝蛋白酶酶解温度选取6 个水平（35、40、45、50、55、60 ℃）；菠萝蛋白酶酶解时间选取6 个水平（1、2、3、4、5、6 h）；菠萝蛋白酶酶用量选取6个水平（10、20、30、40、50、60 U·g-1）。

1.2.4 硫酸软骨素含量检测 硫酸软骨素含量参照GB/T 20365-2006 硫酸软骨素和盐酸氨基葡萄糖含量的测定方法并采用液相色谱法进行含量测定。色谱柱：C18（250 mm×4.6 nm，5 μm）；流动相：乙腈-戊烷磺酸钠溶液（体积分数）=10∶90进行等度洗脱，流速0.8 mL·min-1，检测波长为192 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

1.2.5 胶原蛋白肽含量检测 胶原蛋白肽含量检测参照GB/T5009.5-2003 中的方法测定。蛋白质的换算系数为6.25。

称取充分混匀的固体试样0.2~2.0 g（约当于30~40 mg 氮），精确至0.001 g，至消化管中，再加入0.4 g硫酸铜、6 g硫酸钾及20 mL硫酸于消化炉进行消化。当消化炉温度达到420 ℃之后，继续消化1 h，此时消化管中的液体呈绿色透明状，取出冷却后加入50 mL 水，于自动凯氏定氮仪（使用前加入氢氧化钠溶液，盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A 或B 的硼酸溶液）上实现自动加液、蒸馏、滴定和记录滴定数据的过程。

1.2.6 蛋白分子量范围检测 蛋白分子量范围检测按GB31645-2018 附录A 方法检测。色谱柱：TSKgel G2000 SWXL（300 mm×7.8 nm）；流动相：乙腈-水-三氟乙酸（体积分数）=40：60：0.05；进行等度洗脱，流速0.5 mL·min-1，检测波长为1 220 nm，柱温为30 ℃，进样量为10 μL。

2 结果与分析

2.1 碱性蛋白酶酶解条件的单因素实验分析

2.1.1 酶解温度对酶解效果的影响 在碱性蛋白酶用量为200 U·g-1底物，酶解时间为6 h，以酶解后的蛋白分子量范围为指标，考察酶解温度对酶解效果的影响，结果如图1 所示。升高温度有利于酶解，当温度为45 ℃时酶解效果最好，温度继续增加对酶解效果的改善有限，因此，综合考虑选取酶解温度45 ℃进行优化试验。

图1 酶解温度对碱性蛋白酶酶解效果的影响Fig. 1 Effect of hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis of alkaline protease

2.1.2 酶解时间对酶解效果的影响 在碱性蛋白酶用量为200 U·g-1底物，酶解温度为45 ℃，以酶解后的蛋白分子量范围为指标，考察酶解时间对酶解效果的影响，结果如图2所示。当酶解时间超过2 h后，随着时间的增加，酶解效果增加缓慢，综合考虑时间因素，选择酶解时间为2 h进行优化实验。

图2 酶解时间对碱性蛋白酶酶解效果的影响Fig. 2 Effect of hydrolysis time on enzymatic hydrolysis of alkaline protease

2.1.3 酶用量对酶解效果的影响 在酶解温度为45 ℃，酶解时间为2 h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察碱性蛋白酶用量对酶解效果的影响，其结果如图3 所示。酶用量在100 U·g-1以下时，随着酶用量的增大，酶解效果逐渐提高，之后再增大酶用量对酶解效果影响很小。综合考虑，选择酶用量为100 U·g-1作为最佳酶用量条件。

图3 酶用量对碱性蛋白酶酶解效果的影响Fig. 3 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis of alkaline protease

2.2 木瓜蛋白酶酶解条件的单因素实验分析

以碱性蛋白酶酶解后（酶用量100 U·g-1底物，酶解时间2 h，酶解温度45 ℃）的液体为原料，分别通过改变酶解温度、酶解时间和酶用量3个单因素来研究木瓜蛋白酶酶解条件对酶解效果的影响。

2.2.1 酶解温度对酶解效果的影响 在木瓜蛋白

酶用量为50 U·g-1底物，酶解时间为6 h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察酶解温度对酶解效果的影响，其结果如图4 所示。随着温度的增加，酶解效率呈先增大后减小的趋势，当温度达到50 ℃时，酶解效果最好，故选择酶解温度为50 ℃进行优化实验。

图4 酶解温度对木瓜蛋白酶酶解效果的影响Fig. 4 Effect of hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis of papain

2.2.2 酶解时间对酶解效果的影响 在木瓜蛋白酶用量为50 U·g-1底物，酶解温度为50 ℃，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察酶解时间对酶解效果的影响，其结果如图5所示。当酶解时间为2 h时，酶解效果最好，分子量小于10 000 Da的蛋白占比达到79%，随着时间的增加，结果在79%上下浮动，因此，选择酶解时间为2 h作为最佳酶解时间。

图5 酶解时间对木瓜蛋白酶酶解效果的影响Fig. 5 Effect of hydrolysis time on enzymatic hydrolysisof papain

2.2.3 酶用量对酶解效果的影响 在酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察木瓜蛋白酶用量对酶解效果的影响，结果如图6 所示。当酶用量达到50 U·g-1，再增加酶的用量对酶解效果的提高很小，因此选择酶用量为50 U·g-1作为最佳酶用量条件。

图6 酶用量对木瓜蛋白酶酶解效果的影响Fig. 6 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis of papain

2.3 菠萝蛋白酶酶解条件对酶解效果的影响

以碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解后（碱性蛋白酶用量100 U·g-1底物，酶解时间2 h，酶解温度45 ℃；木瓜蛋白酶用量50 U·g-1底物，酶解时间2 h，酶解温度50 ℃）的液体为原料，分别通过改变酶解温度、酶解时间和酶用量3 个单因素来研究菠萝蛋白酶酶解条件对酶解效果的影响。

2.3.1 酶解温度对酶解效果的影响 在菠萝蛋白酶用量为30 U·g-1底物，酶解时间为6 h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察酶解温度对酶解效果的影响，其结果如图7 所示。随着温度的增加，酶解效率呈先增大后减小的趋势，当温度达到50 ℃时，效果最好，故最佳温度选择50 ℃。

图7 酶解温度对菠萝蛋白酶酶解效果的影响Fig. 7 Effect of hydrolysis temperature on enzymatic hydrolysis of bromelain

2.3.2 酶解时间对酶解效果的影响 在菠萝蛋白酶用量为30 U·g-1底物，酶解温度为50 ℃，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察酶解时间对酶解效果的影响，结果如图8 所示。随着酶解时间的延长，酶解效果总体上呈升高的趋势，考虑到2 h与6 h时的效果仅相差2%，综合考虑后选择酶解时间为2 h进行优化实验。

图8 酶解时间对菠萝蛋白酶酶解效果的影响Fig. 8 Effect of hydrolysis time on enzymatic hydrolysisof bromelain

2.3.3 酶用量对酶解效果的影响 在酶解温度为50 ℃，酶解时间为2 h，以酶解后的蛋白分子量分布为指标，考察菠萝蛋白酶用量对酶解效果的影响，结果如图9 所示。当酶用量为30 U·g-1时，酶解效果最好，分子量小于10 000 Da的蛋白占比达到89%，随着酶用量的增加，酶解效果变化不明显，因此，选择酶用量以30 U·g-1作为最佳条件。

图9 酶用量对菠萝蛋白酶酶解效果的影响Fig. 9 Effect of enzyme dosage on enzymatic hydrolysis of bromelain

2.4 验证试验

综合考虑单因素实验得到的最佳工艺参数及操作的可行性，确定连续分步酶解工艺制备硫酸软骨素与胶原蛋白肽的最佳工艺参数为：碱性蛋白酶用量为100 U·g-1底物，酶解温度45 ℃，酶解时间2 h；木瓜蛋白酶用量为50 U·g-1底物，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h；菠萝蛋白酶用量为30 U·g-1底物，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h。最佳条件下制备的鲟鱼硫酸软骨素的提取率为85%，纯度93%，胶原蛋白肽的提取率为82%，纯度为90%。

3 讨论

本研究以养殖鲟鱼软骨为原料，用pH渐变条件下多酶连续分步酶解工艺，可实现同时制备高纯度的鲟鱼硫酸软骨素与胶原蛋白肽。最佳条件下制备的鲟鱼硫酸软骨素的提取率为85%，纯度93%，胶原蛋白肽的提取率为82%，纯度为90%。

鲟鱼软骨中含有丰富的硫酸软骨素和胶原蛋白，具有很高的应用价值。传统方法提取硫酸软骨素一般需采用大量的碱液和有机溶剂，提取率相对较低。因此，对现有方法进行改良十分必要。周畅等［19］利用响应面方法优化鳐鱼硫酸软骨素提纯工艺，结果表明，最优提取工艺为碱液浓度2.3%、提取温度43 ℃、酶添加量0.7%时，硫酸软骨素提取率为43.32%。与之相比，本文制备的鲟鱼硫酸软骨素的提取率为85%，纯度93%，本工艺大大提高了硫酸软骨素的提取率。胡艺等［20］通过酸溶-胃蛋白酶从鲟鱼软骨中提取的胶原蛋白，相对于加入NaOH 浸泡去除非胶原成分、灭酶活以及加入冰醋酸透析，本文则减少了碱液使用量、且不需要有机溶剂的参与。

综上，本试验为鲟鱼养殖及其副产物的加工提供了一条新的路径，与现有生产工艺相比，操作简单，减少了碱液使用量且不需要有机溶剂的参与，大大提高了硫酸软骨素和胶原蛋白肽的提取率，为硫酸软骨素与胶原蛋白肽的生产方法提供了新的思路与技术数据。