基于网络药理学方法和分子对接技术探究六君二陈解毒汤治疗非小细胞肺癌的潜在作用机制Δ

杨文珂,赵玉荣,王 强,马莉娉,苏占海,董秋霞,马雪曼*

(1.青海大学医学部,西宁 810001;2.青海红十字医院,西宁 810000)

有研究认为,六君二陈解毒汤降低了肺腺癌小鼠肺部转移率[1],但未被广泛认同。本研究基于网络药理学方法和分子对接技术开展相关研究。

网络药理学为探索药物与疾病之间的关系提供了一种新的策略,与中医整体观念、辨证论治的基本思想不谋而合[2]。分子对接技术是一种研究分子(如小分子配体和生物大分子)之间的相互作用并预测其结合模式和亲和力的理论模拟方法[3]。基于网络药理学方法和分子对接技术研究传统中药的潜在药理机制是一种可靠的研究方法。因此,本研究构建六君二陈解毒汤的网络药理模型,用以系统分析六君二陈解毒汤治疗非小细胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)的潜在作用机制,并运用分子对接技术验证预测结果。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 数据库

所选数据库(网址)包括TCMSP数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、Uniport数据库(https://www.uniprot.org)、GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(http://www.omim.org)、PharmGKB数据库(https://www.pharmgkb.org/)、STRING数据库(https://string-db.org/)、DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)、Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/)、RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)、PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)。

1.1.2 软件工具

软件工具包括Venny(2.1)在线工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)、微生信在线工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)和Cytoscape Version(3.9.2)、AutoDock(1.5.6)软件和PYMOL软件。

1.2 方法

1.2.1 网络药理学方法

1.2.1.1 六君二陈解毒汤药物活性成分及靶点筛选

使用TCMSP数据库检索党参、白术、陈皮、甘草、茯苓、半夏、土茯苓和半枝莲的活性成分并进行筛选,设置筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%、类药性(drug-likeness,DL)≥0.18,并将筛选获得的活性成分在TCMSP数据库预测靶点。使用Uniport数据库对预测得到的靶点信息进行标准化,转换为相应靶点名称,得到药物活性成分靶点。

1.2.1.2 NSCLC相关靶点筛选

以“non-small cell lung cancer”为关键词,在GeneCards、OMIM、PharmGKB数据库检索,收集NSCLC相关作用靶点。GeneCards数据库中的疾病靶点筛选标准为得分≥10。对收集到的疾病数据库中的靶点进行汇总,并去除重复值,获得与NSCLC相关的靶点。

1.2.1.3 “中药-活性成分-靶点”网络构建

使用Venny(2.1)在线工具来确定六君二陈解毒汤和NSCLC的交点,并建立韦恩图。采用Cytoscape Version(3.9.2)软件对“中药-活性成分-靶点”网络进行可视化。网络图中的节点为药物名称、活性成分、基因靶点。

1.2.1.4 蛋白质-蛋白质互作(protein-protein Interaction,PPI)网络构建

将1.2.1.3获得的交集靶点输入STRING数据库,建立PPI网络。物种类型设置为“Homo sapiens”,最高置信度设置为“0.900”,隐藏游离节点,其他参数保持为默认,获取PPI网络并保存为TSV文件格式。将获取的数据输入Cytoscape Version(3.9.2)软件进行可视化处理。

1.2.1.5 聚类分析

本研究通过MCODE插件对六君二陈解毒汤-疾病-靶点进行聚类分析,运用Cytoscape Version(3.9.2)软件对聚类分析结果进行可视化处理。

1.2.1.6 GO生物功能和KEGG通路富集分析

本研究利用DAVID数据库对PPI网络中的靶点进行GO生物功能和KEGG通路富集分析,并使用微生信在线工具对GO生物功能和KEGG通路富集分析结果进行可视化处理,绘制气泡图。

1.2.1.7 核心基因靶点表达水平与NSCLC患者预后的相关性分析

运用Kaplan-Meier Plotter数据库对核心靶点进行生存分析,按中位数分组,其他选项均选择默认设置,观察得到该靶点生存曲线的风险比(HR)、95%的置信区间(CI)和对数等级P。

1.2.2 分子对接技术

选取六君二陈解毒汤的主要活性成分与核心靶点进行分子对接。从PDB数据库中下载核心靶点的3D结构,其PDB ID见表1。从TCMSP数据库中下载化合物结构,并保存为mol2格式。靶点蛋白去水除配体的操作由PYMOL软件完成,活性成分及靶点蛋白加氢、加电荷的操作由AutoDock1.5.6软件完成,再运行Auto dockvina软件进行分子对接验证,使用PYMOL软件将对接结果进行可视化处理[4]。

表1 目标蛋白PDB ID

2 结果

2.1 网络药理学预测结果

2.1.1 六君二陈解毒汤活性成分的收集和筛选

检索TCMSP数据库得到六君二陈解毒汤所有活性成分及相关靶点,筛选后共收集到198个药物活性成分,其中白术7个、半夏13个、半枝莲29个、陈皮6个、党参21个、茯苓15个、土茯苓15个、甘草92个。去除无效和重复成分后得到968个潜在作用靶点,其中白术19个、半夏90个、半枝莲223个、陈皮68个、党参109个、茯苓24个、土茯苓205个、甘草230个。采用Cytoscape Version(3.9.2)软件分析六君二陈解毒汤药物活性成分,Degree值居于前十位的活性成分见表2。

2.1.2 NSCLC的疾病靶点筛选

在GeneCards、OMIM、PharmGKB数据库中以“non-small cell lung cancer”为关键词进行筛选,分别获得766、439、305个NSCLC相关靶点,在GeneCards数据库中,以Score≥10为疾病靶点筛选条件获得374个NSCLC相关靶点。合并3个疾病数据库靶点并剔除重复靶点,共获得1 093个与NSCLC相关的靶点,使用Venny(2.1)在线工具绘制韦恩图(图1)并分析,得到12个药物活性成分与NSCLC疾病的共同靶点。

图1 韦恩图

2.1.3 “中药-活性成分-靶点”网络构建

“中药-活性成分-靶点”网络图(图2)中共包括23个节点、22条边。药物活性成分节点图标越大表明其活性成分作用越大、节点越大表明药物对该靶点作用越大。

圆形代表药物成分,菱形代表药物靶点,四边形代表药物名称

2.1.4 PPI网络构建与分析

去除游离靶蛋白后,六君二陈解毒汤治疗NSCLC的PPI网络见图3。该PPI网络共有10个节点和24条边。节点越大代表靶蛋白度值越大;边数连接的越多代表节点靶蛋白在网络中与其他靶蛋白的联系越多。

图3 PPI网络图

拓扑学分析结果如表3所示,共有10个作用靶点(EGFR、CAV1、PTEN、MCL1、CASP8、MET、RASA1、VCAM1、PARK2、IRF1)与治疗NSCLC密切相关。其中,Degree值排名前五位的作用靶点分别为EGFR、PTEN、CAV1、MCL1、CASP8。这些靶点在PPI网络中占据重要地位,与网络中的其他靶点密切相关。

表3 拓扑学分析结果

2.1.5 聚类分析

通过MCODE插件进行聚类分析后得到1个具有相似功能的子簇,涉及8个核心靶点,具体见图4、表4。

图4 聚类分析图

表4 聚类分析表

2.1.6 富集分析

2.1.6.1 GO生物功能富集分析

为进一步明确六君二陈解毒汤的核心生物学功能,使用DAVID数据库对10个核心靶点的生物过程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)和细胞组成(cell component,CC)等方面进行GO分析。在P<0.05的情况下,共得到69个GO条目,包括39个BP条目、13个MF条目和17个CC条目。BP条目共有39个,主要集中在下调细胞凋亡过程(negative regulation of apoptotic process)等方面;MF条目共有13个,主要涉及蛋白激酶结合(protein kinase binding)等;细胞组成(CC)相关条目有17个,主要有细胞溶质(cytoso)、细胞膜(plasma membrane)、细胞质(cytoplasm)。GO生物功能富集分析条带图见图5。

图5 GO生物功能富集分析条带图

2.1.6.2 KEGG通路富集分析

KEGG通路富集的分析结果显示了23个核心靶点的信号通路条目。六君二陈解毒汤治疗NSCLC主要涉及FAK信号通路(Focal adhesion)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、微小核糖核酸信号通路(MicroRNAs in cancer)等信号通路。KEGG功能富集分析气泡图见图6。

图6 KEGG功能富集分析气泡图

2.1.7 潜在治疗靶点相关靶点对NSCLC患者预后的分析

NSCLC患者生存分析曲线由Kaplan-Meier Plotter数据库生成,患者按中位数分组,其他参数均选择默认参数。图7显示,EGFR、CAV1、PTEN、MCL1、MET、RASA1、VCAM1表达与NSCLC患者总生存期(Overall survival,OS)相关(P<0.05)。其中,MCL1靶点低表达患者生存期明显高于高表达患者(P<0.05);EGFR、CAV1、PTEN、MET、RASA1、VCAM1靶点高表达患者生存期明显高于低表达患者(P<0.05);CASP8、PARK2、IRF1靶点表达与患者OS无关(P>0.05)。

x轴代表时间,y轴代表生存可能性

2.2 分子对接验证结果

将六君二陈解毒汤的5个主要成分(槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黄芩苷)与核心靶点(EGFR、PTEN、CAV1、MCL1、CASP8、MET、RASA1、PARK2)逐一进行分子对接,六君二陈解毒汤活性成分与核心靶点结合能热图见图8。结合能越小,说明成分和靶点之间的结合越稳定,β-谷甾醇与MCL1、MET、EGFR对接示意图见图9。通过上述所得,槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黄芩苷与核心靶点EGFR、CAV1、MCL1、MET、RASA1均有较为稳定的结合。其中,β-谷甾醇与核心靶点MCL1、MET、EGFR结合者的能量较低,分别为-4.33、-4.2、-3.94 kJ/mol。

图8 六君二陈解毒汤活性成分与核心靶点结合能热图

图9 β-谷甾醇与MCL1、MET、EGFR对接示意图

3 讨论

本研究运用网络药理学方法预测了六君二陈解毒汤治疗NSCLC的主要有效药物活性成分和核心靶点,并通过分子对接技术得出主要有效药物活性成分与核心靶点的结合能力,验证网络药理学方法预测出的结果,进一步探究六君二陈解毒汤治疗NSCLC的作用机制。

本研究通过对六君二陈解毒汤的药物活性成分筛选分析发现,槲皮素、柚皮素、β-谷甾醇等可能是六君二陈解毒汤治疗NSCLC的主要活性成分。有研究表明,槲皮素可以调节SIRT1/AMPK信号通路诱导NSCLC细胞系自噬和凋亡,从而发挥抗肿瘤作用[5]。柚皮素能够减少基质金属蛋白酶-2(MMP2)和基质金属蛋白酶-9(MMP9)表达,抑制磷酸激酶B(AKT)的活性,降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力,减缓肺癌增殖进程[6]。β-谷甾醇可以阻滞肺癌A549细胞周期,抑制肿瘤细胞的增殖,同时促进细胞凋亡,发挥抗肿瘤作用[7]。此外,β-谷甾醇通过下调硫氧还蛋白(Trx)/硫氧还蛋白还原酶(TrxR1)信号通路引起NSCLC细胞中的ROS依赖性细胞凋亡[8]。上述研究表明,六君二陈解毒汤通过多种药物活性成分发挥治疗NSCLC作用。

本研究通过PPI分析发现,EGFR、PTEN、CAV1等靶点可能是治疗NSCLC的核心靶点。EGFR是刺激DNA合成和影响细胞增殖、转移、侵袭的主要驱动因素[9]。其主要通过EGFR-Ras/Raf/MEK/ERK和EGFR-PI3K/AKT通路增加肿瘤细胞增殖和迁移。此外,EGFR还能够定位于细胞核以促进细胞增殖,同时还能刺激多种促进癌症侵袭和转移的基质金属蛋白酶发挥促进肿瘤生长和转移的作用[10]。PTEN可以调节肿瘤微环境,抑制细胞外基质重塑,促进肿瘤细胞的侵袭和转移[11-12]。此外,PTEN还能够负向调节PTEN/PI3K/Akt通路,调控细胞生长、凋亡和迁移[13-14]。在高分化的NSCLC肿瘤中,高达70%的PTEN蛋白表达下调与PI3K/AKT通路激活有关[15-16]。CAV1参与多种肿瘤相关的生物学过程,包括细胞迁移侵袭、细胞转化、血管生成等[17]。CAV1的表达量与肺癌细胞的增殖呈正相关,CAV1表达下调可以阻滞细胞周期来抑制肺癌细胞的增殖[18]。研究表明,MCL1在癌细胞中的过表达会破坏抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白之间的平衡,从而阻止癌细胞发生凋亡,导致恶性增殖[19]。此外,MCL1的PEST结构域与PH结构域上的AKT相互作用以激活AKT,共同促进肺癌进展[20]。上述研究表明,六君二陈解毒汤作用于多靶点发挥治疗NSCLC作用。

本研究对六君二陈解毒汤治疗NSCLC进行GO生物功能和KEGG通路富集分析,结果显示NSCLC的发生发展主要与细胞凋亡,RNA聚合酶II启动子的转录,FAK、PI3K-Akt信号通路调控有关。六君二陈解毒汤可能通过下调细胞凋亡过程,上调RNA聚合酶II启动子的转录,调控细胞FAK、PI3K-Akt信号通路发挥治疗NSCLC的作用。有研究表明,在一些恶性肿瘤中,FAK被激活而过度表达[21]。靶向FAK激酶结构域的小分子抑制剂(如PF-573,228)现已被开发为对NSCLC等癌症的靶向治疗方法[22-23]。PI3K/Akt信号通路与NSCLC的发生发展密切相关。激活PI3K/Akt信号通路可抑制细胞凋亡,促进肿瘤血管生成及肿瘤组织的侵袭和转移[24]。上述研究表明,六君二陈解毒汤治疗NSCLC是通过多条通路发挥治疗作用的。

本研究采用Kaplan-Meier-Plotter数据库分析了六君二陈解毒汤作用于NSCLC核心靶点的生存曲线。结果表明,六君二陈解毒汤可能是通过降低EGFR、CAV1、PTEN、MET、RASA1、VCAM1基因表达,增加MCL1基因表达发挥抗肿瘤作用。有研究表明,40%至80%的NSCLC预后不良患者与EGFR过度表达有关[25]。EGFR突变主要是外显子19的缺失,外显子21、密码子858的亮氨酸替代精氨酸的点造成[26]。MCL1的过表达与肿瘤预后不良和耐药性增强密切相关。MCL1 mRNA或蛋白的表达与多种癌症类型的肿瘤进展和患者不良结局有关。有研究发现,MCL1的扩增可影响中国南方人群中NSCLC患者的OS[27]。在人NSCLC细胞的一个亚群中发现MCL1的过表达[28]。高水平的MCL1可以保护肺癌细胞,避免各种促凋亡行为刺激诱导肺癌细胞死亡[29]。上述研究表明,六君二陈解毒汤可以通过多靶点改善NSCLC患者的预后。

本研究基于分子对接技术验证六君二陈解毒汤的主要药物活性成分槲皮素、柚皮素、木犀草素、β-谷甾醇、黄芩苷与核心靶点EGFR、MCL1、MET、RASA1、PARK2之间的相互作用。当结合能小于0时,表明配体与受体可以自行结合。结合能越低,氢键数量越多,结合就越稳定,疾病靶点与药物活性成分作用的可能性就越大。对接结果表明,β-谷甾醇能够作用于MCL1而促进细胞凋亡,抑制肿瘤生长。验证了网络药理学预测六君二陈解毒汤药物活性成分作用于NSCLC靶点的可行性。

本研究结果显示,六君二陈解毒汤以多成分-多靶点-多通路的方式在NSCLC中发挥治疗作用。