青海玛多地区藏族学龄肥胖儿童粪便非靶向代谢组学分析※

艾丽孜热·艾尼瓦尔,马 燕,2,闫 馨,吴子怡,杜文琪#

(1.青海大学医学部公共卫生系,西宁 810001;2.青海大学高原医学研究中心,西宁 810001)

肥胖是目前威胁人类健康的疾病之一,它可导致相关并发症,如胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)、非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver diseases,NAFLD)和2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等[1,2]。在全球范围内,肥胖的患病率呈上升趋势[3]。目前我国最新的流行病学调查显示学龄儿童肥胖的患病率存在地理差异,高海拔地区肥胖的患病率明显低于平原地区,但在高海拔地区肥胖的发生率较高。因此,明确不同地域肥胖的发生机制,有助于预防和控制我国学龄儿童超重和肥胖现状。故本研究采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)技术对青海玛多地区藏族儿童的粪代谢物进行非靶向代谢组学检测,为高海拔地区藏族儿童肥胖发生机制研究提供研究思路。

1 对象与方法

1.1 对象

选取青海省玛多县(海拔4 300 m)7～12岁藏族儿童作为研究对象。按照相关诊断标准[4]将研究对象分为肥胖组和正常体质量组;通过分层整群抽样法选择12名藏族肥胖儿童(HOB:High-altitude obesity),并匹配12名正常体质量藏族儿童(HN:High altitude normal)。采用病例-对照研究法,分别采集两组研究对象的粪便样品作为检测样本。所纳入的儿童均为寄宿生,有相同的膳食结构。纳入的研究对象在粪便采集前食用2周的标准饮食。两组研究对象的年龄和身高无明显差异,体质量和身体质量指数(BMI)在两组间存在显著性差异(P<0.01),详见表 1。

表1 两组研究对象一般情况

儿童监护人同意参加本研究并签署相关知情同意书。本实验所涉及的人群研究获青海大学医学院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂选择

质谱仪(Q ExactiveTMHF,Thermo Fisher)、色谱仪(Vanquish UHPLC,Thermo Fisher)、低温离心机(D3024R,Scilogex);甲醇(A456-4,Thermo Fisher)、甲酸(A117-50,Thermo Fisher)、醋酸铵(A114-50,Thermo Fisher)。

1.2.2 样本采集与制备

使用一次性粪便采样盒收集新鲜粪便200 mg放入3 mL保存液中混匀,置-80℃冰箱保存。样品制备:(1)取100 μL样本置EP管中,加入400 μL 80%甲醇水溶液;(2)涡旋振荡,静置(冰浴)5 min后离心(15 000 g,4℃,20 min);(3)取一定量的上清加超纯水稀释至甲醇含量为53%;(4)离心(15 000 g,4℃,20 min)后收集上清,应用 LC-MS 技术进行分析[5,6]。用两组样本提取液等量混合配制QC样本进行质量控制。

1.2.3 色谱柱及质谱条件设定

色谱柱为Hypesil Gold column色谱柱(C18,100 mm×2.1 mm,1.9 μm,Thermo Fisher)。正离子检测模式下,流动相A:甲醇,流动相B:0.1%甲酸水溶液;负离子检测模式下,流动相A:甲醇,流动相B:5 mM醋酸铵水溶液(pH 9.0)。梯度洗脱:0～1.5 min,2% A;1.5～3.0 min,2%～85% A;3～10 min,85%～100% A;10.0～10.1 min,100%～2% A;10.1～12.0 min,2% A。柱温:40℃;流速:0.2 mL/min。质谱条件:喷雾电压为3.5 KV;鞘气流速为35 psi;辅助气流速为10 L/min;离子传输管温度为320℃;离子导入射频电平为60;辅助气加热器温度为350℃;一级分辨率为60 000;二级分辨率为15 000;扫描范围为100～1500。二级扫描为数据依赖性扫描(DDA,data dependent scans)。

1.2.4 数据处理及统计分析

将数据(.raw)文件导入搜库软件(Compound Discoverer 3.1,简称CD 3.1)进行预处理及代谢物鉴定。采用公共数据库(KEGG、HMDB和LIPID Maps数据库)对鉴定的代谢物进行注释。使用SIMCA14.1软件进行PCA、OPLS-DA分析,得到每个代谢物的VIP值。用MetaboAnalyst5.0进行独立样本t检验来判断统计学显著性,并计算代谢物在两组间的FC值。筛选差异代谢物的默认标准为VIP>1、P<0.05且FC≥2或FC≤0.5[7,8]。应用KEGG数据库对差异代谢物进行通路富集分析。

2 结果

2.1 青海玛多地区藏族肥胖儿童粪便代谢轮廓分析

图1(聚类热图)直观展现了所有样本的聚集性,表明组内样本较聚集。通过PCA、OPLS-DA分析法,在整体水平上对代谢物的组间差异进行可视化分析,各组样本代谢物在组内的分布是均匀的,在组间的分布存在差异。

图1 正离子模式(左图)和负离子模式(右图)粪便样本的层次聚类

OPLS-DA模型显示,左图:R2Y=0.981,R2X=0.278,Q2=0.820;右图:R2Y=0.964,R2X=0.292,Q2=0.838。R2>Q2,说明模型不存在过拟合。代谢物在正负离子模式下都有一定的差异,提示粪代谢样本存在代谢差异。图2、图3显示,样本存在离群情况,这可能与样本量及粪便质量等因素相关。

图2 正负离子模式下PCA得分图

图3 正负离子模式下OPLSDA得分图

2.2 差异代谢物筛选

通过KEGG、HMDB、Lipid Maps数据库对代谢物进行定性、定量分析。从数量上看,两组样本(HN、HOB)在正离子模式下筛选出927个代谢产物,在负离子模式下筛选出554个代谢产物。HN与HOB组在正离子模式下筛选出差异代谢物20个,其中5个代谢物上调、15个代谢物下调;在负离子模式下筛选出差异代谢物14个,其中11个代谢物上调、3个代谢物下调。见表2。

表2 正负离子模式下差异代谢物及上下调个数

表3 正负离子模式FC值>2的显著差异代谢物

2.3 相关代谢途径富集分析

图4 差异代谢物富集通路

表4 显著富集通路

3 讨论

本研究两组研究对象的PCA及OPLS-DA结果显示,两组样本组内分布均匀,组间存在一定差异。结果显示,大部分化合物以脂质分子为主,其脂质分子占比呈现增高趋势,结论与大部分的肥胖研究结果一致[9]。具体哪一类脂质分子起到关键性的生物标志物作用需要进一步研究阐明。

根据FC值对差异代谢物进一步筛选,贡献较大的代谢产物有6个脂质化合物、2个有机酸类化合物、4个苯环及类苯环化合物,它们的占比均表现为上调趋势,其中α-酮戊二酸、柠檬酸作为三羧酸循环中的关键中间产物,与糖、脂肪分解及能量产生密切相关[10]。

KEGG通路富集分析结果显示,叶酸碳库代谢,柠檬酸盐循环代谢,乙醛酸和二羧酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路显著富集(P<0.05)。柠檬酸循环代谢物被认为是细胞代谢的主要副产物,对核苷酸、脂质和蛋白质等大分子的生物合成很重要[11]。柠檬酸盐循环的分析机制:通过丙酮酸脱羧酶将丙酮酸转化为线粒体OAA和谷氨酰胺,谷氨酰胺转化为谷氨酸,随后转化为α-酮戊二酸。当α-酮戊二酸水平下降时,柠檬酸盐从线粒体输入到细胞质中进行脂质合成。本研究中,α-酮戊二酸含量上升,影响了脂质从头合成机制。另外一些柠檬酸盐循环中间体的产生可以通过谷氨酰胺依赖性还原羧化的过程来维持,在该途径中,通过NADPH依赖性异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)和乌头酸酶(ACO)催化两个后续反应,从谷氨酰胺衍生的α-酮戊二酸产生柠檬酸盐[12]。还有研究表明,α-酮戊二酸、富马酸、草酰乙酸、柠檬酸、苹果酸等作为三羧酸循环中的关键中间产物,与糖、脂肪分解及能量产生密切相关[10]。其中α-酮戊二酸是决定三羧酸循环总体速率的关键分子[13]。三羧酸循环和氨基酸代谢存在一定的交互关系,三羧酸循环中间产物如草酰乙酸、α-酮戊二酸分别是天冬氨酸和谷氨酸的前体。丙酮酸在胰腺导管腺癌中与葡萄糖和谷氨酰胺衍生的碳竞争,为三羧酸循环提供燃料[14]。谷氨酸被谷氨酸脱氢酶或谷草转氨酶转化为三羧酸循环中间物α-酮戊二酸[15]。谷氨酸是氨基酸能量代谢途径的一种底物,可经由谷氨酰胺途径在谷氨酰胺酶的作用下生成,并能通过生成α-酮戊二酸进入三羧酸循环,独立于葡萄糖为三羧酸循环供能[16]。本研究的代谢通路也涉及柠檬酸循环代谢,乙醛酸、二羧酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢,是通过影响脂质从头合成,影响三羧酸循环的中间产物,来改变能量代谢。这可能与青海玛多地区学龄藏族儿童长期的饮食结构密切相关,藏族家庭遵循民族传统的生活方式和饮食习惯,每天主要摄入高脂肪、高碳水、低膳食纤维类食物,故能量摄入较其他地区多[17]。因此,我们假设玛多地区学龄儿童肥胖发生机制也与能量代谢相关的通路密切相关。

本研究存在一定的局限性:样本较局限;由于非靶向代谢组学无偏向性,故发现的差异代谢物存在一定偏差。因此,在后续研究中应进一步增加样本量,并进行靶向代谢组学研究。

综上所述,本研究通过非靶向代谢组学方法,对青海玛多地区不同体质量的肥胖藏族儿童的粪代谢水平进行了分析,获得了3种富集于柠檬酸盐循环代谢,乙醛酸、二羧酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代谢的差异代谢物叶酸、柠檬酸、α-酮戊二酸,为梳理肥胖的发病机制提供了新的思路。