朝医鹿茸大补汤通过WNT5A和TLR4信号通路交互调节气道重塑的机制研究

李 欢,刘凯月,黄丹丹,刘若白,李良昌,延光海,郑明昱

(吉林省过敏性常见疾病免疫与靶向研究重点实验室,延边大学医学院,吉林 延吉 133002)

支气管哮喘(bronchial asthma)属朝医学“哮喘”范畴,是以气道炎症(airway inflammation)和气道重塑[1](airway remodeling)为明显病理标志的呼吸系统疾病。鹿茸大补汤为太阴人哮喘代表方剂,有补肺气益精血的功用。课题组前期研究显示鹿茸大补汤能够通过WNT5A、TLR4等通路调控哮喘相关蛋白的表达[2],但是对通路间是否存在交互作用尚未验证。故本次利用朝医鹿茸大补汤对WNT5A和TLR4信号通路交互调节的机制进行研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料、试剂

1.1.1细胞 人支气管上皮细胞(BEAS2B)购买于广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.1.2药品与试剂 鹿茸10 g,麦冬、薏苡仁各7.5 g,麻黄、山药、杏仁、天冬、五味子各5 g,购自延吉市北京同仁堂第一分店药店。按照文献[3]记录方法由延边大学药学院制作鹿茸大补汤冻干粉,用DMSO溶解后微孔滤膜过滤。冻干粉的主要成分为哌嗪类生物碱、类黄酮、氰苷类、甾体类等,与水煎液HPLC结果一致[4]。anti-WNT5A(货号bs-1984R)、anti-TLR4(货号bs-1021R)、anti-NF-κB p65(货号bs-20160R)、anti-β-Actin(bs-0061R)购自北京博奥森有限公司。

1.1.3仪器 AI600超灵敏化学发光成像仪(美国GE公司);cytation5多功能成像酶标仪箱(美国Bio-Tek公司)。

1.2 实验方法

1.2.1细胞的分组 将细胞分为正常组、IL-13组、DMSO组、LRDBT组、DEX组;W+T-组(ICG+TAK-242)、W+T+组(ICG+LPS[5])、W-T+组(FrpHE+LPS)、W-T-N+组(FrpHE+TAK-242、+PMA),以上处理药物均为100 μmol·L-1,处理后共同给予10 μg·L-1的IL-13刺激细胞24 h。

1.2.2MTT药物浓度筛选 给予不同浓度的鹿茸大补汤冻干粉,检测A值。

1.2.3Western blot检测WNT5A、TLR4和NF-κB蛋白表达 提取细胞蛋白,进行蛋白印迹实验。

1.2.4免疫荧光(IF)检测细胞内NF-κB蛋白表达 加入抗体培养,在成像仪下观察拍照。

2 结果

2.1 MTT药物浓度筛选与Control组相比,IL-13刺激组细胞的增殖量明显升高(P<0.01),以2.5 mg·L-1为药物浓度梯度进行MTT实验,结果显示鹿茸大补汤冻干粉浓度为10 mg·L-1时细胞增殖趋于稳定(P<0.01)。

2.2 Western blot 检测细胞中 WNT5A、TLR4和NF-κB 蛋白水平的表达与Control组相比,W+T-和W-T+组中以上蛋白表达上升;与W+T-和W-T+组相比,W+T+组以上蛋白表达明显上升。与Control组相比,IL-13组和DMSO组中以上蛋白表达水平上升;与IL-13组和DMSO组相比,LRDBT组和DEX组以上蛋白表达水平下降。

2.3 IF检测细胞内NF-κB 表达在微孔成像仪下观察拍照可知,与Control组相比,IL-13组胞内荧光亮度增高,证明NF-κB的表达升高;与IL-13组相比,LRDBT组胞内荧光亮度减弱,证明NF-κB的表达降低,且在核内胞质均有表达。

3 讨论

气道重塑中TLR4和WNT信号通路均可激活NF-κB,另一方面LPS与TLR4结合并激活NF-κB以诱导WNT5A的表达[6]。综上所述,鹿茸大补汤不仅单独调控WNT5A或TLR4信号通路,还可以抑制WNT5A和TLR4信号通路交互作用对NF-κB叠加影响,进而改善气道重塑,为哮喘的治疗提供了另外的选择。