高糖环境中雄激素受体对心肌成纤维细胞增殖和脂质合成能力的影响

温 馨,周 洋,林丽婵,刘芷言,宋 凯,陶 辉,臧洪梅

(1.安徽医科大学药学院,安徽 合肥 230032;2.安徽医科大学第三附属医院药学部,合肥市第一人民医院, 安徽 合肥 230061;安徽医科大学第二附属医院 3.心胸外科、4.麻醉科, 安徽 合肥 230601)

心血管的相关并发症是糖尿病的首要致死原因,其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病特异性的心脏并发症,主要是高血糖引起的微血管弥漫性损伤导致[1]。在排除冠状动脉疾病、高血压或瓣膜性心脏病等器质性心脏病后,DCM可发生心脏功能障碍,并与糖尿病患者的预后密切相关[2]。

其中,高血糖引起的心肌纤维化是糖尿病心肌病的重要病理生理过程,而在心肌纤维化中,心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)的异常激活和增殖起到重要作用[3]。已经有研究报道,氧化应激、代谢异常均可以影响心肌成纤维细胞的增殖[4],在肺纤维化中发现[5]促纤维化TGF-β信号转导需要脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN),但是目前脂质合成对心肌成纤维细胞增殖的研究较少。已经有研究报道雄激素受体(androgen receptor,AR)参与糖尿病心肌纤维化中的心肌成纤维细胞焦亡[6]和自噬[7]。同时,AR还参与肿瘤相关的脂质合成[8],促进肿瘤的增殖[8-9]。但是,AR是否能够调控心肌成纤维细胞的脂质合成尚不明确。因此,本研究通过高糖刺激CFs构建体外模型,探讨在高糖环境下,AR对CFs的脂质合成和增殖能力的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物 本研究使用新生1～3 d的C57BL/6乳鼠进行原代心肌成纤维细胞的提取,动物从安徽医科大学动物实验中心获得,使用许可证号为SYXK(皖)2017-006。

1.1.2主要试剂 DMEM高糖培养基(武汉赛维尔公司);胎牛血清(Gibco公司);Ⅱ型胶原酶(德国Biofroxx公司);0.25%胰蛋白酶(碧云天生物有限公司);一抗抗体AR(22089-1-AP)、FASN(10624-2-AP)、PCNA(10205-2-AP)、Cyclin D1(26939-1-AP)、α-SMA(BM0002)、Collagen Ⅰ(14695-1-AP)、GAPDH(60004-1-Ig)均购于Proteintech公司; AR过表达质粒由合肥通用生物合成;逆转录试剂盒(艾瑞克生物公司);油红O试剂(武汉赛维尔公司);CCK-8试剂盒(合肥Biosharp公司)。

1.1.3主要仪器 细胞培养箱(上海Heal Force公司);酶标仪(美国赛默飞公司);荧光显微镜(日本OLYMPUS公司);实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司);Nano Photometer分光光度计(德国IMPLEN公司);低温高速离心机(德国EPPENDORF公司)。

1.2 实验方法

1.2.1原代心肌成纤维细胞的分离和培养 选取1～3天的新生乳鼠进行原代CFs培养,体表消毒后放入超净工作台中,于无菌大号细胞皿中进行心脏解剖。获得心脏后,在预冷的PBS中清洗去除心腔中残留的血液,并剪去多余的大血管和心脏表面的脂肪组织。心脏移入离心管中充分剪碎,并加入混合消化酶(0.25% 胰蛋白酶和0.2% Ⅱ型胶原酶以2 ∶1的体积比混合)进行37 ℃水浴消化。将消化液通过200目筛网过滤获得细胞悬液,离心后留取细胞沉淀,加入DMEM高糖培养基重悬后种板。在培养2～3 h后进行换液去除未贴壁的细胞,剩下的贴壁细胞继续培养。

1.2.2原代CFs的细胞转染 待原代CFs生长至对数期进行转染操作,弃去培养基后,使用无血清培养基进行转染,配置适量转染复合物并在室温充分混合孵育10 min。完成孵育后将转染复合物均匀滴加到各组CFs中,“8”字摇晃使培养体系充分混匀。转染8 h后,更换完全培养基继续培养,根据后续实验要求收集各组实验样本。

1.2.3实验分组 探究高糖对CFs影响的分组,空白对照组(blank control,Control组):不做任何处理组;高糖模型组(high glucose,HG组):高糖刺激CFs 24 h。探究高糖环境下过表达AR对CFs作用的分组,阴性对照组(negative control,NC组):在高糖刺激24 h后,进行空载质粒的转染;AR过表达质粒组(AR-overexpression plasmid,pcDNA3.1-AR组):在高糖刺激24 h后,进行AR过表达质粒的转染。

1.2.4细胞总RNA的提取及逆转录 取各组对数生长期的CFs进行总RNA提取,弃去培养基后使用PBS清洗细胞,预冷的TRIzol充分裂解细胞,加入氯仿(氯仿的体积为加入TRIzol体积的20%)富集RNA,在4 ℃低温离心机离心后收集上层液相。加入适量异丙醇助沉后再次离心获得总RNA,使用75%乙醇洗涤2次RNA后加入适量无酶水进行溶解。溶解后的RNA通过Nano Photometer光度计检测浓度,根据逆转录试剂盒说明进行逆转录,将RNA逆转录成cDNA,并于-20 ℃保存。

1.2.5RT-qPCR检测相关mRNA的表达 取各组cDNA样本进行RT-qPCR实验,依据试剂盒要求加入各组样本配置成20 μL的反应体系,上机检测mRNA的表达。本实验所用的引物序列见Tab 1。最终检测结果以GAPDH作为内参,每一组mRNA的相对表达量采用2-△△CT计算后进行数据统计。

Tab 1 RT-qPCR primer synthesis sequences

1.2.6Western blot检测相关蛋白的表达量 根据实验分组进行蛋白上样,每孔蛋白的上样量为25-30 μg,通过凝胶电泳分离蛋白,200 mA 恒流转膜。将PVDF膜牛奶封闭后,进行一抗孵育过夜。GAPDH的一抗稀释浓度为1 ∶5 000,AR、FASN、PCNA、cyclin D1、α-SMA、collagen Ⅰ的一抗稀释浓度为1 ∶1 000。次日回收一抗后进行二抗孵育40 min,最后进行ECL显影。

1.2.7CCK-8检测细胞增殖能力的改变 取各组CFs以5×104个的数量进行96孔板种板,每组设置3个复孔。24 h后每孔中加入CCK-8试剂并继续培养4 h,完成培养后通过酶标仪进行450 nm处的吸光度检测。

1.2.8油红O染色检测细胞的脂质合成能力 取处在对数生长期的各组CFs进行实验,弃去培养基后,PBS进行清洗3遍后,用4%多聚甲醛室温固定15 min。PBS再次清洗后,使用60%异丙醇浸泡5 min,然后进行10min的油红O染色。完成染色后,流水漂洗多余的染料,并进行苏木精复染细胞核。最后加入油红O Buffer浸润细胞,1 min后弃去并加入蒸馏水覆盖后镜下(放大倍数200×)观察染色结果。

1.2.9免疫荧光 取各组CFs进行细胞爬片,细胞汇合度在70%左右时进行免疫荧光染色。PBS进行清洗细胞3遍,再用4%多聚甲醛室温固定15 min。再次清洗后,0.5% TritonX-100进行室温通透10 min。山羊血清封闭1 h后进行α-SMA、collagen Ⅰ一抗孵育过夜(稀释比例均为1 ∶200),次日清洗一抗后使用荧光二抗Alexa Fluor 488进行孵育,最后含DAPI的抗淬灭剂封片使用荧光显微镜进行观察(放大倍数200×),并留存图像。

2 结果

2.1 原代CFs培养及鉴定如Fig 1所示,在完成原代CFs提取后,分别于1 d和3 d在镜下观察CFs的生长状态。1 d后已经完成贴壁的心肌成纤维细胞均呈不规则形或长梭形样贴壁生长(Fig 1A),3 d的心肌成纤维细胞几乎铺满整个视野,生长状态良好,折光性强(Fig 1B)。通过波形蛋白的免疫荧光染色(Fig 1C)发现,细胞染色阳性率为96%,可以鉴定为心肌成纤维细胞。

Fig 1 Observation of primary cardiac fibroblast growth and immunostaining identification

2.2 高糖环境下,心肌成纤维细胞中脂质合成和细胞增殖能力的改变CFs种板后在高糖环境下培养24 h,通过油红O检测脂滴发现,高糖刺激的模型组中脂滴染色与对照组相比明显增加,差异具有统计学意义(P<0.01),结果见Fig 2A。此外,CCK-8检测CFs活性发现,在高糖刺激后,高糖模型组中CFs的细胞增殖能力相比对照组上升,差异具有统计学意义(P<0.01),见Fig 2B。

2.3 高糖环境下,心肌成纤维细胞中FASN和PCNA的变化为了进一步研究CFs中影响脂质合成和增殖改变的具体机制,分别通过Western blot和RT-qPCR检测CFs中脂质合成酶(fatty acid synthase,FASN)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白及mRNA的变化。如Fig 3A所示,Western blot检测发现,相比对照组,模型组CFs中FASN和PCNA的蛋白表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05);如Fig 3B所示,通过 RT-qPCR检测发现,模型组CFs中Fasn、Pcna和Ccnd1的mRNA表达相比对照组上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.4 高糖环境下,心肌成纤维细胞中AR、collagen Ⅰ、α-SMA的变化AR是否能够调控脂质合成以及脂质合成的异常是否影响心肌纤维化是我们感兴趣的问题。因此,我们检测了高糖环境下,CFs中AR、collagen Ⅰ、α-SMA的含量。如Fig 4A所示, Western blot检测发现,相比对照组,模型组CFs中纤维化相关蛋白collagen Ⅰ和α-SMA的蛋白表达上调,但是AR的蛋白表达被抑制的,差异具有统计学意义(P<0.05);如Fig 4B所示,通过 RT-qPCR检测发现,高糖刺激后CFs中Col1a1和Acta2的mRNA表达相比对照组上调,而Ar的mRNA水平降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,如Fig 4C所示,免疫荧光实验也证明高糖模型组中的collagen Ⅰ和α-SMA的蛋白表达上调。

2.5 过表达AR后,心肌成纤维细胞中FASN、PCNA、Cyclin D1、collagen Ⅰ、α-SMA的变化如Fig 5A所示,Western blot检测质粒转染后的AR蛋白水平发现,AR的蛋白水平相比空载对照组升高,差异具有统计意义(P<0.05),证实过表达质粒载体转染成功。同时,与空载对照组相比,FASN、PCNA、Cyclin D1、collagen Ⅰ、α-SMA的蛋白水平下降,差异具有统计意义(P<0.05)。如Fig 5B所示,通过 RT-qPCR检测发现,在过表达AR后,CFs中Ar的mRNA水平升高而Fasn、Pcna、Ccnd1、Col1a1、Acta2的mRNA水平下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.6 过表达AR后,心肌成纤维细胞中脂质合成和增殖能力的改变在过表达AR后,通过油红O检测脂质发现,过表达组中脂质染色与对照组相比减少,差异具有统计学意义(P<0.05),见Fig 6A。此外,CCK-8检测CFs活性发现,过表达组中CFs的细胞活性相比对照组下降,差异具有统计学意义(P<0.05),见Fig 6B。

Fig 2 Changes of lipid synthesis and cell proliferation capacity in cardiac fibroblasts under high glucose n=3)

Fig 3 Expression of FASN and PCNA in cardiac fibroblasts under high glucose n=3)

Fig 4 Expression of AR, collagen Ⅰ and α-SMA in cardiac fibroblasts under high glucose n=3)

Fig 5 Changes of FASN, PCNA, Cyclin D1,Ar,collagen Ⅰ and α-SMA in myocardial fibroblasts after

3 讨论

DCM是糖尿病患者排除无器质性心脏病的存在,仍出现心脏结构和功能改变的糖尿病并发症之一[10]。由于高糖引起的氧化还原的损伤,线粒体受损[11]和心肌纤维化等一系列病理变化会损害心肌收缩力和心脏功能,最终甚至会导致心衰的发生[10],同时脂质代谢在心衰中的作用也越来越受关注[12]。此外,在DCM中可以观察到异常的脂质蓄积,产生的脂毒性会损伤心肌细胞[13]。丰富的脂质蓄积为细胞供能,促进肿瘤的增殖[14]。其中,FASN是参与脂肪酸生物合成的关键酶,也是肥胖、非酒精性脂肪性肝病等代谢性疾病的重要靶标[15]。在FASN缺失时,可以降低前列腺癌的侵袭性[16],同时抑制FASN和上游的甾醇调节元件结合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBP)也是一种肿瘤潜在的治疗策略[17]。在肺纤维化的研究中发现,FASN 的抑制可以降低了促纤维化靶标蛋白的表达,而且使肺功能得到改善[5]。本研究也发现类似的实验结果,FASN 可能会是日后纤维化的治疗靶点之一。

Fig 6 Changes of lipid synthesis and cell proliferation

CFs是参与心肌纤维化的主要效应细胞,但是脂质代谢的异常在CFs中的作用少有探究。AR作为核转录因子参与糖尿病心肌纤维化的表观遗传调控[18],但是AR对心肌成纤维细胞脂质合成的影响尚不明确。作为转录因子的AR可能结合SREBP或直接调控FASN的表达影响脂质合成为细胞增殖提供能量,还可能直接影响细胞周期相关蛋白等提供增殖所需的物质基础。本研究通过体外实验模拟高糖环境,探讨CFs中脂质合成的变化和AR在脂质合成中的作用和可能机制。在高糖环境下,油红O和CCK-8实验表明CFs中脂质合成和增殖能力较空白对照组明显增强。RT-qPCR与Western blot结果也表明,高糖环境下CFs中的FASN、PCNA、collagen Ⅰ、α-SMA表达升高,而AR的表达下调。在过表达AR后,CFs中的FASN、PCNA、collagen Ⅰ、α-SMA表达受到抑制;同时CFs中脂质合成和增殖能力相比空载体组减弱。综上所述,本研究通过体外实验证明,在高糖环境下,AR可能通过上调FASN促进CFs的脂质合成和增殖。实验结果丰富了DCM的相关机制研究,也为日后DCM的诊疗提供了指导方向。