氢氧化镧通过阻断HIF-1α信号通路抑制慢性肾病所致的血管钙化

崔雅婷,王琪雯,王胜男,李 刚

(1. 内蒙古自治区呼和浩特市第一医院药剂科,2. 内蒙古医科大学药学院药理学教研室,内蒙古 呼和浩特 010110)

血管钙化可能会导致心血管疾病的风险增加,尤其在患有慢性肾病(chronic kidney disease,CKD)的患者中,这种风险的增加更为明显。随着年龄的增长,血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的表型变化对CKD的影响越来越明显,其表型变化可以通过羟基磷灰石的大量沉积来实现,这种钙化反应可以通过骨矿化的方式来实现[1-3]。此外,由于CKD会使血磷水平增加,这也会对VSMC的表型变化产生一定的影响[4]。CKD是一种严重的慢性疾病,其发生主要是因为身体内的细胞功能障碍,如贫血、微血管病变[5-6],这些因素会使人体陷入缺氧的状态,并且这种情况会对VSMC钙化及成骨样表型的形成产生重要影响。

低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor 1,HIF-1)是一种转录复合物,可调节细胞和系统对氧气可用性的稳态反应。HIF-1是由氧敏感的HIF-1α和组成型表达的HIF-1β亚基组成的异二聚体。其中HIF-1α的氧依赖性调节是一个多步骤的过程,包括在常氧条件下降解,但在低氧条件下稳定,转移到细胞核并激活。对缺氧的适应是正常细胞发育、分化及缺血等病理环境中的关键事件。作为体内平衡的中枢介质,HIF-1α可以使细胞在低氧环境中存活[7-9]。Li等[10]研究表明,2型糖尿病患者血清中HIF-1α的水平与血管钙化呈正相关。Perrotta等[11]研究发现,HIF-1α与狭窄血管中的新生血管生成和钙化区域共定位。此外,还有研究发现高磷是一种新的HIF-1诱导剂和激活剂[12]。这些研究均强调了HIF-1在血管钙化中的重要作用。

氢氧化镧是一种新型镧类化合物,白色固体,难溶于水,较容易吸收空气中的二氧化碳,是目前本课题组研究较多的稀土配合物。课题组前期研究已经证明,氢氧化镧可降低血磷水平,减少血管钙化的发生[13-14],但未对其改善血管钙化的作用机制进行研究。前期通过网络药理学的方法,筛选发现血管钙化与缺氧有很大的相关性,并通过KEGG分析发现HIF-1α信号通路与血管钙化有较强相关性。因此,本文研究氢氧化镧是否通过HIF-1α通路对CKD及其并发症血管钙化产生影响,提出CKD血管钙化治疗可能的新策略,以期实现CKD血管钙化新型治疗药物和靶点的发现。

1 材料

1.1 实验动物Wistar大鼠,♂,6～8周龄,体质量(200～220) g,购自北京市维通利华实验动物科技公司,生产许可证号:SCXK(京)2016-0006。大鼠饲养于内蒙古医科大学动物实验中心的SPF级屏障区,温度(21～22) ℃,湿度40%～50%,适应性饲养7 d后开始实验。动物实验经内蒙古医科大学医学伦理委员会批准(文件编号:YKD2019019)。

1.2 药物与试剂氢氧化镧(批号:2020年9月,纯度96%),由本实验室合成;碳酸镧(货号:54451-24-0)、碳酸钙(货号:471-34-1)、腺嘌呤(货号:73-24-5),均购自Sigma-Aldrich公司;磷(Pi)测试盒(货号:C006-1-1)、钙(Ca)测定试剂盒(货号:C004-2-1)、血肌酐(serum creatinine,Scr)测定试剂盒(货号:C011-2-1)、血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)测定试剂盒(货号:C013-2-1),均购自南京建成生物工程研究所;大鼠成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor 23,FGF23)ELISA试剂盒(货号:F4444-B)、大鼠甲状旁腺激素(parathyroid hormone,PTH)ELISA试剂盒(货号:F4378-B),均购自上海易利生物科技有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b,TRAP-5b)ELISA试剂盒(货号:E-EL-H1551c),购于Elabscience;von Kossa染色试剂盒(货号:G1043)、EVG染液套装(货号:G1042),均购自武汉赛维尔生物科技有限公司;抗小鼠IgG(H+L)(货号:A23910)、抗兔IgG(H+L)(货号:A23920),均购自Abbkine公司;骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)抗体(货号:sc-137087)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)抗体(货号:sc-101145),均购自Santa Cruz Biotechnology公司;β-actin抗体(货号:K101527P),购自北京索莱宝科技有限公司;Lamin A抗体(货号:10298-1-AP),购自Proteintech公司;HIF-1α抗体(货号:ab32152),购自Abcam公司;NE-PERTM细胞核和细胞质提取试剂(货号:78833),购自ThermoFisher Scientific公司;总RNA提取试剂盒(货号:DP419),购自天根生化科技(北京)有限公司;反转录试剂盒(货号:FSQ-101)、SYBR Green荧光定量检测试剂盒(货号:QPK-201),均购自TOYOBO Life Science公司。

1.3 主要仪器Molecular Devices多功能酶标仪(SpectraMax i3x,美谷分子仪器有限公司);荧光定量PCR仪(PiKoreal96,美国ThermoFisher公司);BIO-RAD基础电泳仪[伯乐生命医学产品(上海)有限公司];Odyssey红外激光成像系统(Odyssey CLX,美国LI-COR公司);高速冷冻离心机(3-18K,Sigma公司);病理切片机(RM2016,上海徕卡仪器有限公司)。

2 方法

2.1 实验动物造模、分组及给药采用腺嘌呤建立Wistar大鼠CKD模型。在1～2周内,给予大鼠2%的腺嘌呤混悬液,每日灌胃,第3～4周隔天给予2%的腺嘌呤混悬液灌胃。最终,从大鼠的眼底静脉丛采集血样本,检测血清磷、肌酐及尿素氮水平,判断该模型是否成功构建。模型建立成功后,大鼠随机分为6组:模型组、氢氧化镧(LH 0.1、0.2、0.4 g·kg-1)组、碳酸镧(LC 0.3 g·kg-1)组、碳酸钙(CC 0.42 g·kg-1)组,每组10只,造模成功后开始给药,给药时间为8周。给药组每天给予相应剂量的药物灌胃,模型组每日给予生理盐水灌胃。另随机选择10只Wistar大鼠作为空白对照(Control)组。

2.2 血清学指标检测分别通过脲酶法、肌氨酸氧化酶法、MTB法,测定血清中的BUN、Scr、Ca水平;ELISA法检测血清中PTH、FGF23、TRAP-5b水平。

2.3 胸主动脉病理学检查使用4%的多聚甲醛固定大鼠的胸主动脉,包埋切片。

2.3.1von Kossa染色 取大鼠胸主动脉段,用石蜡包埋后,4 μm厚切片,常规脱蜡、脱水。1%硝酸银溶液浸泡,日光下照射30 min后,将玻片浸入5%硫代硫酸钠溶液1 min,后用碱性品红返染。脱水、透明、封片,用光镜观察。

2.3.2EVG染色 将染液A、B、C依照5 ∶2 ∶2的比例配制,将其加入到染液中,并用清水清洁。然后,将染液B加倍,使其略有分离,再用清水清洁,最后通过显微镜观察,将染液的浓度调节到一定范围,使其变为紫黑色,而背面则变为接近于无的灰白色。将EVG染液E 9 mL与D 1 mL按百分比混合,制备VG染液,洗涤1～3 min(根据组织中弹力玻璃纤维的含量而定,洗涤时间过短会导致胶原色素变浅,而洗涤时间过长则会使弹力玻璃纤维褪色),然后迅速用清水冲洗,无水乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。

2.4 qPCR检测大鼠胸主动脉SM22α、BMP-2、Runx2、VEGF mRNA表达根据RNA提取试剂盒说明书,提取大鼠胸主动脉RNA,逆转录为cDNA。然后,利用cDNA作为模板,进行qPCR扩增,该qPCR实验体系包括:cDNA模板2 μL,上、下游引物各0.8 μL,SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10 μL,无RNase水6.4 μL。qPCR仪的工作模式是:将温度调节到95 ℃,持续30 s;95 ℃、5 s,60 ℃、10 s,72 ℃、15 s,进行40个循环;在60 ℃延伸步骤对荧光信号进行采集,反应结束后,观察熔解曲线及扩增曲线,分析qPCR 引物的特异性。采用2-△△CT法测定样品中目的基因的相对表达水平,选择稳定表达的GAPDH作为内参。引物序列见Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for qPCR

2.5 Western blot检测大鼠胸主动脉组织细胞质和细胞核中蛋白表达取大鼠主动脉组织50 mg,剪成细小的碎片,加入500 μL完全RIPA裂解液,冰上充分研磨、裂解。将研磨好的组织倒入离心管中,涡旋2 min,冰上静置10 min,重复3次。4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,取上清液,BCA法对蛋白进行定量。蛋白煮沸变性后,进行SDS-PAGE电泳,转膜,封闭后,将膜放入一抗中,4 ℃孵育过夜,洗膜后加入二抗,37 ℃避光孵育1 h。将膜放在红外激光成像仪上进行图像分析,使用ImageJ v1.8.0软件,对胞质中BMP2、SM22α、VEGF和HIF-1α蛋白的表达水平进行测量,使用目的蛋白与内参β-actin的比值反映其表达量。此外,对细胞核中的HIF-1α和RUNX2蛋白的表达水平进行测量,使用目的蛋白与内参Lamin A的比值反映其表达量。

3 结果

3.1 氢氧化镧可改善CKD大鼠血清学指标如Tab 2所示,给予氢氧化镧、碳酸镧、碳酸钙治疗8周后,CKD大鼠的血清Pi浓度、Scr、BUN、PTH、FGF23和TRAP-5b水平均明显下降(P<0.01),Ca浓度无明显变化。

3.2 氢氧化镧对CKD大鼠血管钙化的影响如Fig 1所示,HE和von Kossa染色检测表明,与对照组相比,模型组的胸主动脉血管变得更加粗糙,而且其中膜出现了更多的黑色钙化;给予氢氧化镧后,CKD大鼠的血管钙化沉积有了明显的改善,与其他钙化治疗方法相比,碳酸钙的疗效却很有限。大鼠胸主动脉EVG染色结果表明,与对照组相比,模型组大鼠的主动脉血管钙化区域的弹性纤维明显减少,甚至出现了断裂现象;与模型组相比,氢氧化镧可改善弹性纤维的断裂,但碳酸钙组作用不明显。

3.3 氢氧化镧可影响CKD大鼠胸主动脉SM22α、BMP-2、RUNX2、VEGF mRNA表达Fig 2结果显示,给予氢氧化镧8周,SM22α mRNA的表达明显升高(P<0.05),BMP-2、RUNX2和HIF-1通路的下游蛋白VEGF mRNA的表达水平明显降低。提示氢氧化镧治疗8周,可逆转模型组这些基因的表达异常。

3.4 氢氧化镧可影响CKD大鼠胸主动脉SM22α、BMP-2、RUNX2、VEGF、HIF-1α蛋白的表达为了更好地研究氢氧化镧是否能够抑制血管钙化的发生和发展,需要探究其是否能够阻断HIF-1通路的活性,因而检测了SM22α、BMP-2、RUNX2,以及HIF-1通路中HIF-1α、VEGF的蛋白表达情况。Fig 3结果显示,与对照组相比,模型组BMP-2的表达量明显增加,而血管平滑肌标记性蛋白SM22α的表达则有所下降,说明VSMC已经开始发生骨骼转化。与对照组相比,模型组细胞质内的HIF-1α表达明显降低,同时下游蛋白VEGF表达明显升高;与模型组相比,给予氢氧化镧(0.1、0.2、0.4 g·kg-1)、碳酸镧、碳酸钙后,CKD大鼠HIF-1α表达升高,VEGF表达降低。

Tab 2 The serum biochemical test results of rats with chronic renal failure hyperphosphatemia at 8 weeks

Fig 1 HE staining, von Kossa staining and EVG staining of thoracic aorta slices of rats with chronic renal failure

Fig 2 Effect of lanthanum hydroxide on mRNA expression of SM22α, BMP-2 (A), RUNX2

如Fig 4所示,与对照组相比,模型组血管细胞核内RUNX2蛋白的表达量明显增加,说明VSMC已经开始发生骨骼转化,给予氢氧化镧、碳酸镧、碳酸钙后该蛋白的表达量降低。模型组细胞核内HIF-1α表达明显升高(P<0.01);与模型组相比,给予氢氧化镧(0.1、0.2、0.4 g·kg-1)、碳酸镧、碳酸钙后,CKD大鼠血管胞核内HIF-1α的表达分别降低了约24%、38%、49%、41%、23%。

4 讨论

本文实验研究发现,一种新型磷结合剂——氢氧化镧能够有效抑制慢性肾衰血管钙化的发生发展,并且通过血清学指标检测、胸主动脉组织病理学检查、qPCR及Western blot,证实其能够有效阻断HIF-1通路,从而达到抑制血管钙化的目的。

HIF-1α是一种氧调节蛋白,对氧的浓度十分敏感,被称为“缺氧基因的表达总开关”[15-18]。常氧条件下,HIF-1α被VHL识别后,会经由蛋白质的泛素化水解反应被降解。但是,如果细胞处于缺氧的环境,则会对HIF-1α的降解产生阻碍,从而使其更容易与HIF-1β相互作用,促进HIF-1靶基因的转录[19]。SM22α、BMP-2、RUNX2和VEGF是与细胞分化和血管生成相关的一些蛋白质。SM22α是一种平滑肌特异性蛋白质,主要在平滑肌细胞中表达,其在细胞分化和收缩中起着重要的调节作用。BMP-2是一种骨形态发生蛋白家族成员,对骨细胞分化和骨组织生成起着重要的调节作用,其被广泛应用于骨再生和骨修复的临床治疗中。RUNX2是一种转录因子,对骨细胞分化和骨组织形成起关键作用,是骨发育和骨再生过程中的重要调节因子[20-21]。VEGF是一种促血管生成的蛋白质,对血管发生、生长和修复具有重要作用,在组织修复和再生过程中起关键调节作用。这些蛋白质在细胞分化、骨组织生成和血管生成等方面的研究,对于理解相关疾病的发生机制以及开发相关治疗方法具有重要意义。TRAP-5b是一种酸性磷酸酶,也被称为骨吸收标记物,在骨骼系统中发挥重要作用,特别是在骨重塑和骨吸收过程中。TRAP-5b主要存在于成熟的骨吸收细胞(如巨噬细胞、骨吸收细胞),它参与了骨骼的正常代谢和再生。在骨吸收过程中,TRAP-5b可降解骨骼中的无机磷酸盐和有机骨基质,促进骨重塑和骨质疏松。由于TRAP-5b的特定表达与骨吸收过程有关,其被广泛用作评估骨代谢活动和骨质疏松症的标志物。本研究发现,给予氢氧化镧治疗后,抑制了高磷诱导的活性氧的产生,可明显减少CKD大鼠胸主动脉的钙沉积、胞质中BMP-2、VEGF表达,以及胞核内RUNX2、HIF-1α的表达,增加SM22α的表达,进而抑制了VSMC的转分化和钙化[22-23]。

Fig 3 Effect of lanthanum hydroxide on HIF-1α, BMP-2, SM22α and VEGF expression

Fig 4 Effect of lanthanum hydroxide on HIF-1α and RUNX2 protein expression in nucleus of thoracic aorta of CKD n=4)

综上所述,氢氧化镧可抑制慢性肾衰血管钙化的发生及发展,其可能通过阻断HIF-1通路的激活来抑制CKD所致的血管钙化。本研究为氢氧化镧成为临床候选药物奠定了临床前期药理学研究基础。