HPV E6/E7在自噬调控中的作用机制研究进展

杨二琴,党晓庆,王志莲

自噬在病毒感染的反应中调节细胞命运[1],在维持细胞稳态和功能中发挥关键作用[2]。大量证据表明,自噬不仅对氧化应激、DNA损伤、缺氧、营养缺乏、内质网应激以及外源生物或药物的暴露做出一系列适应性反应,以维持体内平衡,而且还参与了人类疾病的发展,包括癌症、脑卒中、神经退行性疾病等[3-5]。在鳞状细胞癌癌变发生早期,人乳头瘤病毒E6/E7蛋白(human papillomavirus E6/E7 protein,HPV E6/E7)可抑制自噬,而在后期E6/E7可重新激活自噬[3],E6/E7可通过多条途径使自噬标志物LC3-II减少和P62积累,来阻止自噬溶酶体的降解,从而抑制自噬[6]。宫颈癌的发生发展与HPV密切相关,为探讨HPV E6/E7在自噬调控中的作用,为宫颈癌等HPV相关疾病的诊断及靶向治疗提供一定的思路,本文将对HPV E6/E7在自噬调控中的机制展开综述。

1 E6/E7通过视网膜母细胞瘤蛋白p53、pRb调控自噬

研究表明,p53可通过激活参与启动和形成自噬小体的关键基因蛋白ULK 1、ATG7以及DRAM触发自噬,还可通过激活AMPK激活子1和激活子2等基因来触发自噬[7-8]。HPV E6/E7可以降解p53和pRb,从而调控自噬。HPV E6可引起p53降解,使p53功能丧失,从而导致自噬下调。高危型HPV(high-risk human papillomavirus,HR-HPV)E7可降解pRb,同时释放转录因子E2F,转录因子E2F可以诱导LC3、ULK1、ATG5和DRAM的转录[9],导致自噬的上调。总之,HR-HPV E6可以降解p53,下调自噬,E7可降解pRb,上调自噬。

2 E6/E7通过PI3K-AKT-mTOR通路调控自噬

E6/E7可激活并维持PI3K-AKT-TOR通路来抑制自噬。HPV16 E6/E7与表皮生长因子受体(EGFR)作用可激活PIK3CA/PI3K-AKT-mTOR轴,从而抑制自噬,HPV E6的异位表达通过抑制AKT-mTOR和MAPK/ERK-mTOR通路诱导自噬[10]。HPV16 E7蛋白可与蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)的亚基结合,阻止PP2A与磷酸化Akt(p-Akt)的相互作用并保持其活性,E6也可以激活Akt,从而维持PI3K-AKT-mTOR通路来抑制自噬,E6还可与TSC2结合,导致其降解并刺激mTORC1[11-12],而磷酸化的mTORC1可以抑制自噬[13]。

3 E7通过调节beclin-1调节因子1(AMBRA1)调控自噬

E7通过竞争性结合AMBRA1及促进AMBRA1降解抑制自噬。与HPV阴性肿瘤相比,AMBRA1的表达和细胞自噬水平在HPV阳性肿瘤中均降低,这说明AMBRA1可能对细胞自噬有调控作用[14]。beclin-1是促自噬PIK3C3/VPS34复合物的一种成分,AMBRA1的中心区域与beclin-1结合,从而促进自噬,HPV16 E7以不同于AMBRA1结合beclin-1的方式直接结合于AMBRA1[15],HPV16 E7通过表达降低了AMBRA1与beclin-1的相互作用,这表明HPV16 E7和beclin-1在竞争AMBRA1蛋白上的相同结合区域。此外,HPV16 E7可以由钙蛋白酶依赖性方式介导AMBRA1的降解,从而抑制自噬。有研究证明钙蛋白酶2(CAPN2)通过降解两种自噬关键蛋白ATG3和ATG7来抑制自噬[16],该研究发现CAPN2与AMBRA1相互作用,而HPV16 E7表达增加了AMBRA1-CAPN2相互作用,这表明AMBRA1降解是通过CAPN2触发的[16]。总之,HPV E7与AMBRA1相互作用、竞争其与beclin-1结合并触发其钙蛋白酶依赖性降解的能力来抑制自噬。

4 E6/E7直接调节自噬相关蛋白调控自噬

E6可以直接上调自噬相关蛋白基因转录及蛋白表达促进自噬,E7可以直接上调自噬相关蛋白表达促进自噬。Tingting等[17]发现,HR-HPV E6/E7通过调节SiHa和Caski细胞中自噬相关蛋白水平可以直接激活自噬,HPV16 E6可能在转录水平上调节参与自噬小体形成和运输的ATG9蛋白和参与自噬小体-溶酶体融合的LAMP-1,HPV16 E6对HEK293细胞中的Atg9B和LAMP1的转录具有正调控作用,当HPV16 E6过度表达时,Atg9B和LAMP1-mRNA均增加。另有研究表明,与对照细胞相比,在表达E6的细胞中,催化ATG12-AT5组装的ATG10酶表达上调,自噬标记物Beclin-1和LC3-II增加,而P62保持较低水平,这表明E6对自噬有诱导作用[10]。HPV16 E7可以直接与ATG9和LAMP-1结合,并可促进ATG9B和LAMP1的表达,通过免疫沉淀分析发现HPV16 E7与Atg9B相互作用,而不与LAMP1相互作用,HPV16 E7和Atg9B之间的相互作用促进了自噬溶酶体的形成和降解,从而促进自噬[17]。据报道,在宫颈鳞状上皮内病变组织中,HPV16 E6/E7随着病变级别的升高表达增加,而ATG12表达水平随着病变级别的升高反而呈下降趋势[18-19]。ATG12在HPV阴性的头颈部鳞状细胞癌中表达缺失,可以减少头颈部鳞状细胞癌的缺氧状态,通过碳源及谷氨酰胺依赖途径维持缺氧状态下细胞的生存,并改善肿瘤预后[20]。因此,HPV E6/E7可能通过上调ATG12的表达来调节自噬。

5 E6/E7通过调节衰老基因表达调控自噬

E6/E7可抑制衰老相关基因表达从而抑制自噬。E6/E7的耗竭会诱导W12宫颈角质形成细胞自噬,同时观察到W12宫颈角质在转染E7敲低模型后,衰老标记物β-半乳糖苷酶在所有W12宫颈角质系列受试细胞中的平均表达率较对照组显著增高[21],这说明自噬的诱导与细胞衰老有关。实验表明,E6/E7的缺失可以诱导衰老表型、衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)以及固有免疫应答上调,从而引起自噬基因上调,促进自噬[21]。这与衰老和先天免疫反应途径的富集有关,HPV E6/E7缺失后,SASP上调[22],该基因可以招募能够清除衰老细胞的先天免疫细胞,上调SASP相关mRNA(如IGFBP3和SERPINE1)以及与先天免疫反应相关的因素,包括细胞因子(如IL1β)和干扰素刺激基因[23],从而促进自噬。

6 E6/E7通过泛素蛋白酶体系调节自噬

E6/E7通过抑制泛素蛋白酶体系来上调自噬。E6和E7都是蛋白酶体介导的降解目标,E6募集泛素连接酶(E6-associated protein,E6AP)靶向介导p53进行蛋白酶体介导的降解,E6可以类似地由E6AP靶向介导进行自身降解[24]。E7募集ZER1/CUL2-RING泛素连接酶复合物以促进pRb的降解,E7也通过SOCS1接头复合物和/或SCF(Skp-Cullin-F box)泛素连接酶复合物(包含Cullin1和Skp2)来介导靶向自身降解[25-26]。E6和E7分别是去泛素酶(DUB) USP11和USP15的靶标,并且E6和E7与涉及泛素化和去泛素化的因子相关[27-28]。蛋白酶抑制剂降低靶向这些病毒癌蛋白DUB的水平或活性,从而导致E6和E7泛素化增加,增加其降解。通过触发蛋白酶抑制剂,可以逆转HPV16驱动的细胞自噬标志物的积累,从而诱导自噬[29]。因此,E6/E7可触发蛋白酶抑制剂来抑制泛素蛋白酶体系从而诱导自噬。

同时,蛋白酶抑制剂诱导的自噬对控制内质网应激很重要,而内质网应激又可以激活自噬。当蛋白质不能正确折叠时,错误折叠的蛋白和未折叠蛋白可以通过内质网相关降解通路(ERAD)降解,如果未折叠蛋白持续积累,细胞会激活自噬。一旦内质网应激反应开始并进展,细胞可以尝试通过激活自噬途径来降解累积的蛋白质从而恢复内质网稳态[30]。因此,内质网应激也可激活自噬。

7 E6/E7通过调节线粒体损伤调控自噬

CararoLopes等[31]研究提示,在HRasG12V活性下的HPV E6/E7角质形成细胞中,HPV E6/E7蛋白降解p53和pRb的活性被抑制,但高HRasG12V活性下启动了一系列应激,导致有丝分裂信号的不协调,进而导致复制损伤和氧化应激,两者都导致了DNA损伤,进而引起线粒体损伤。此时,为清除受损线粒体、减少氧化应激,E6/E7会激活自噬。因此,E6/E7可能通过调节线粒体损伤来调控自噬,自噬可能通过调节线粒体损伤来发挥作用。

HPV E7通过CerS1/神经酰胺依赖的线粒体自噬诱导细胞死亡。通过HPV E7信号通路,以线粒体为靶点的c18神经酰胺介导线粒体自噬,HPV E7抑制Rb信号是调控神经酰胺依赖性致死线粒体自噬的关键,HPV E7神经酰胺介导的线粒体自噬是由E2F5-Drp1复合物诱导的,HPV E7通过抑制Rb激活E2F5,增强了神经酰胺诱导的线粒体自噬,HPV16 E7通过激活细胞质E2F5功能,选择性介导HNSCC细胞死亡,瞄准Rb激活的E2F5,使其结合并稳定Drp1寡聚体作为支架分子,诱导Drp1线粒体转位和线粒体分裂,导致含有LC3的自噬体的神经酰胺募集和随后的线粒体自噬[32]。

8 总结与展望

E6/E7调控自噬存在两面性。一方面,自噬使得肿瘤细胞能够耐受生存肿瘤微环境的应激(缺氧、高能量需求等)和毒性治疗。另一方面,自噬对于减少可促进肿瘤发生的基因组损伤非常重要。HPV E6/E7对自噬的调节表现为既能上调又能抑制自噬,可能是HR-HPV和LR-HPV E6/E7对自噬的影响存在差别以及时间顺序依赖性的表现不同。有研究表明HR-HPV和LR-HPV都可以调节自噬,在病毒感染过程中,早期阶段HR-HPV E6/E7抑制自噬,以阻止病毒的清除,在后期阶段,HR-HPV E6/E7蛋白为满足与癌细胞代谢相关的需求,在癌症发展和维持过程中可能会重新激活自噬[33-34]。关于LR-HPV,有研究者认为在病毒感染过程可以激活自噬,以增加细胞能量需求或消除未折叠和错误折叠的宿主蛋白。与来自HR-HPV的E6相反,来自LR-HPV11的E6通过诱导Akt和mTORC1蛋白去磷酸化而失活,此外,来自HPV11的E6促进细胞外信号调节激酶(ERK)的去磷酸化和失活,从而下调mTORC1水平,促进自噬诱导。这些结果表明,LR-HPV中的E6通过AKT-mTOR和ERK-mTOR的下调促进自噬[10]。

HPV E6/E7对自噬的调节表现出两面性,这也可能是HPV E6/E7功能拮抗的表现。研究表明,HR-HPV的E6和E7可以不同地调节氧化应激(OS),其中E6可诱导OS和DNA损伤,而E7可以保护OS,减少氧化环境[35-36]。在上皮-间充质转化(EMT)过程中,E6促进EMT,而E7降低EMT[37],当两种蛋白质都过表达时,它们的作用被中和[35-36],因此HPV E6/E7对自噬调节的表现受E6/E7功能相对强弱的影响而表现为既能上调自噬又能抑制自噬。

目前对HPV E6/E7在自噬过程中的作用相关研究还待深入,不同调节通路之间是否存在共同部分及如何相互影响需进一步明确。HR-HPV与LR-HPV E6/E7表达差异及生物学行为差异可能导致了对自噬调节的差异。E6/E7对自噬过程中的不同环节均有影响,E6/E7对自噬具体的调节方式、调节通路还需更多的研究来明确,HPV E6/E7在自噬中的作用到底如何,以及这两种蛋白发挥激活与抑制作用的具体环境及条件,需要进一步研究探讨。