趋化因子CX3CL1具有抗小鼠肝纤维化的潜在作用

程 琦，李 宁，鱼康康，施光峰

复旦大学附属华山医院 感染科，上海 200040

肝纤维化是各种致病因子造成肝损伤后组织异常增生。据报道有25%～40%的肝纤维化患者后期发展为肝硬化、肝衰竭,甚至肝癌导致死亡[1-2]。肝纤维化的发病机制非常复杂,迄今为止尚无行之有效的治疗措施。1997年发现的趋化因子CX3CL1[chemokine(C-X3-C motif)ligand 1,CX3CL1]是 CX3C-类趋化因子中仅有的一种[3]。除了血液中,其他组织也发现CX3CL1的表达。通常CX3CL1表达有利于平衡免疫系统,但当机体处于炎性状态,CX3CL1协同其他趋化因子和细胞因子将淋巴细胞趋化至炎部位。CX3CL1在免疫、炎性反应中起很重要的作用[4-5]。近期研究表明CX3CL1的异常表达升高和处于炎性状态下促炎因子的分泌具有一定相关。趋化因子在急、慢性肝病起重要作用,能通过浓度梯度趋化一些免疫细胞(如NK细胞、T细胞等),进入受损的肝脏发挥作用[6-7]。本研究通过检测肝纤维化小鼠肝脏中的趋化因子CX3CL1水平,探索其在肝纤维化中作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:C57BL/6小鼠,雄性,SPF级,周龄为4～6周(中国科学院上海斯莱科实验动物中心)。复旦大学实验动物中心为饲养实验动物地点(SPF级,温度为22 ℃,湿度为55%,12 h白天/黑夜)。

1.1.2 主要试剂:小鼠 CX3CL1抗体(R&D公司),小鼠IFN-γ和CX3CL1 ELISA试剂盒(Abcam公司),四氯化碳(CCl4,上海氯碱化工公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分组: 实验小鼠随机分为2组,每组各8只。肝纤维化造模组采用腹腔注射四氯化碳(CCl4)[8],具体为10% CCl4(橄榄油配制)腹腔注射,为3次/周,每次注射量为2 mL/kg,为期6周。正常对照组(control)给予正常喂养,同时腹腔注射0.9%氯化钠溶液作为对照。

1.2.2 HE染色观察病理:使用10%甲醛溶液中固定小鼠肝组织24 h。流水过夜冲洗使其水化,再以乙醇逐级脱水,二甲苯渗透,用石蜡包埋,切成厚度为5 μm切片后染色。

1.2.3 肝脏组织CX3CL1 mRNA及蛋白的测定:取小鼠肝脏组织,抽提组织RNA,使用RT-qPCR法检测组织的CX3CL1 mRNA以及Western blot法测定CX3CL1蛋白表达。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.4 ELISA法检测血清中CX3CL1和IFN-γ水平:小鼠心脏采血,离心血清,依照ELISA试剂盒说明书,按步骤检测小鼠血清中CX3CL1和IFN-γ的表达水平。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠的状态变化

对照组小鼠呈现良好状态,较为活泼,毛发光泽好,进食量正常。而模型组小鼠较少活动,精神较差,毛发蓬乱且无光泽,饮食量减少,尿黄明显。

2.2 肝脏组织学改变

对照组小鼠肝组织可见完整肝小叶结构,肝细胞整齐排列,肝窦未见充血和出血,细胞结构正常。模型组小鼠肝脏组织结构不完整,中央静脉周围区可见较多气球样变及细胞坏死。汇管区可见增宽,部分单核、淋巴细胞浸润和纤维组织及部分胆小管增生,汇管区可见放射状纤维条索,可见大小不一的假小叶形成(图1)。

A.control group; B.model group.

2.3 小鼠肝组织CX3CL1的变化

模型组肝组织的CX3CL1 mRNA水平明显高于对照组(P<0.01)(图2)。相应的,在模型组肝组织中CX3CL1蛋白表达明显高于正常对照组(图3)。

*P<0.01 compared with the control group.

图3 Western blot法检测肝脏组织CX3CL1表达Fig 3 Expression of CX3CL1 in liver tissue by Western blot

2.4 小鼠血清IFN-γ和CX3CL1的分泌

通过ELISA检测法示模型组血清中IFN-γ表达量显著低于对照组,血清中CX3CL1水平明显高于对照组(P<0.01)(表2)。IFN-γ相关其表达和CX3CL1呈负相关。

表2 小鼠血清IFN-γ和CX3CL1表达Table 2 Level of serum CX3CL1 and IFN-γ(pg/mL)

3 讨论

肝纤维化形成的中心环节是肝星状细胞的激活。近年来研究发现趋化因子在肝脏出现炎症和纤维化过程中能调节激活肝星状细胞。慢性肝病患者在疾病发展的不同阶段呈现CX3CL1及其受体的不同表达。肝纤维化早期患者血清能检测到较高水平的CX3CL1,而在肝硬化末期CX3CL1水平呈现低表达[9]。体外研究发现肝星状细胞能通过刺激ADAM10和ADAM17分泌CX3CL1。同时体外研究还发现HSC本身可分泌CX3CL1,提高肝脏和全身CX3CL1水平[10]。另外在慢性丙型肝炎患者及原发性胆汁性胆管炎患者中发现CX3CL1及其受体CX3CR1表达上调,但是其在肝脏疾病中的作用仍然不明。

本研究发现在肝纤维化模型小鼠中,小鼠血清CX3CL1水平明显高于正常对照组,表明CX3CL1在肝纤维化过程中可能起一定作用。不仅如此,在肝脏组织中, CX3CL1 mRNA表达水平也有类似的改变,推测CX3CL1可能和肝脏损伤有关系。

HSC的激活能影响血清中CX3CL1的分泌。尽管血清中发现CX3CL1的表达升高,而在肝硬化患者肝内检测到CX3CL1的受体表达却很低,这可能由于肝脏损伤后期CX3CR1表达缺乏造成的[11]。由此认为CX3CL1在终末期肝病后期难以发挥相应的作用。

近年来有研究表明肝脏内的免疫细胞(如NK细胞、巨噬细胞)可产生具有抗纤维化作用IFN-γ进而直接杀死活化的肝星状细胞,从而起到抗肝纤维化的效果[12-13]。肝纤维化小鼠IFN-γ水平明显低于模型组。推测CX3CL1可能通过调节IFN-γ的水平而对肝纤维化起作用。

研究CX3CL及其受体CX3CR1在肝脏的表达水平及其调控机制,探寻其临床意义, 明确对肝纤维化发病机制的作用具有重要价值。未来应用CX3CL1基因敲除、 转基因或单克隆抗体等技术,有望促进临床转化应用,为肝纤维化治疗提供参考。