鱼类低值副产物制备抗菌肽研究进展

2023-12-08李海蓝陈亚楠刘文博赵青廖涛鉏晓艳

食品研究与开发 2023年23期

李海蓝，陈亚楠，2，刘文博，3，赵青，2，廖涛，4，鉏晓艳，4*

（1.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，湖北武汉 430064；2.湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北武汉 430000；3.武汉工程大学化学与环境工程学院，湖北武汉 430205；4.农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室，湖北武汉 430000）

抗生素是20世纪最伟大的发现之一，但由于传统抗生素的长期过量使用，使得耐药变异菌株泛滥，对人类的健康造成一定的威胁。目前，抗菌肽被认为是最具有潜力代替抗生素的天然物质[1]，其作为具有广谱抗微生物活性的小分子多肽，由20～50 个氨基酸残基组成，且通常富含阳离子，具有两亲性，广泛分布于动物、植物与微生物中，如天蚕[1]、绵羊[2]、林蛙[3]、虹鳟鱼[4]、豇豆[5]、乳酸链球菌[6]等，在它们的宿主先天防御功能中起到重要的作用[7]。其中，种类繁多的鱼类是抗菌肽的重要来源，同时，鱼类来源抗菌肽也有一些独有的特性，它即使在非常高的盐浓度下也能发挥作用，这成为开发治疗性抗菌剂的良好潜在靶点[8]。

近年来，随着国内外鱼类加工技术的不断进步，鱼类加工产业也处在持续发展阶段。但对于一些低值鱼类，其虽然具有体型小、营养丰富、种类繁多及产量大的优点，但却因为其加工产业链短，经济效益低而造成了资源浪费[9]。同时，鱼类在加工过程会产生大量的低值副产物，如鱼头、鱼骨、鱼皮、鱼鳞、鱼内脏等，占原料鱼体质量的30%～50%[10]。这些副产物一直没有被高效利用，它们大部分被浪费丢弃，或者用于生产一些低附加值产品，如饲料鱼粉[11]。然而，近年来，这些副产物逐渐被用于生产一些蛋白质水解物和生物活性肽[9，12-15]，抗菌肽作为其中的一种生物活性肽，因在食品及医药领域具有良好的应用前景，而受到越来越多研究者的关注[7]。

目前，大量研究者开始在鱼类低值副产物中寻找潜在的抗菌肽，这些抗菌肽可能在其母体蛋白质序列中并不活跃，因此需要合适的方法将其释放出来[16-19]。总体来说，生产抗菌肽的传统方法包括化学水解法（酸或碱水解）[20]、酶水解法[21]和微生物发酵法[22-24]。然而，由于化学水解法会引入一些有毒的化学品，所以酶水解法和微生物发酵法是生产抗菌肽最广泛使用的方法[25]。同时，一些新兴的新技术，如脉冲电场和亚临界水萃取法，也逐渐被用来生产一些生物活性肽，以提高生物活性成分的产率[26]。

然而从鱼类低值副产物中生产抗菌肽的研究相对较少，也不够深入，大多研究仅停留在提取分离阶段，只对微生物的活性进行评价。因此，本文主要综述鱼类低值副产物中抗菌肽的来源、制备方法以及对其抗菌活性的评价方法，旨在为鱼类低值副产物中抗菌肽的制备生产提供理论参考，并促进对抗菌肽的研究，增加其利用价值。

1 抗菌肽主要来源

抗菌肽可能存在于鱼类的多个部位，如器官、黏液、血液或组织中[8]，然而在鱼类加工副产物中，抗菌肽的提取原料大多来源于内脏和鱼皮，仅有较少研究从鱼鳞和鱼骨中提取抗菌肽（见表1）。

表1 抗菌肽的来源和制备方法以及抗菌活性检测方法Table 1 Sources and preparation methods of antimicrobial peptides and detection methods of antibacterial activity

1.1 鱼鳞

鱼鳞是对鱼体具有重要保护作用的结构，其主要由羟基磷灰石与胶原蛋白组成，其蛋白质含量约占总量的50%[43]。由于鱼鳞中存在丰富的胶原蛋白，大多数研究者使用酸提法或者蛋白酶水解法处理鱼鳞，以从鱼鳞中提取胶原蛋白肽[44]与抗氧化肽[12]，有研究者使用胃蛋白酶水解鲫鱼鱼鳞，并通过凝胶过滤层析与阴离子交换层析进行分离纯化，得到了对多种致病菌具有良好抗菌活性的抗菌肽[35]。目前，更多的研究是将从鱼鳞中提取的胶原蛋白或羟基磷灰石与某些抗菌活性材料复合，从而有效提升其抗菌性能[45-46]。Kulkarni 等[47]将麦瑞加拉鲮鱼鱼鳞中提取的胶原蛋白与壳聚糖共混制备出了具有抗菌功效的新型生物降解膜。

1.2 鱼骨

钙和骨胶原蛋白是鱼骨中的主要组成部分，其蛋白质含量约占总量的15%[48]。灰分是鱼骨中含量最高的成分，其主要成分是钙，主要以羟基磷灰石结晶的形式存在，钙磷比为1.67[49]。有研究表明，从鱼骨和鱼鳞中提取的羟基磷灰石均具有抗菌活性，而鱼骨中的羟基磷灰石抗菌活性更好。目前很少有研究从鱼骨中提取抗菌肽，仅有Ren 等[36]使用胃蛋白酶酶解斑点叉尾鮰（Ictaluruspunctatus）鱼骨，并通过响应面法对水解条件进行优化，最后得到了对大肠杆菌具有较好抗菌活性的抗菌肽，其抑菌圈直径达到19.8 mm。

1.3 鱼皮

鱼皮占鱼类总质量的8%～10%，其总蛋白质含量占20%以上，主要为胶原蛋白[50]。和鱼鳞相同，大多数研究关注鱼皮中胶原蛋白的提取及生物活性分析。然而，由皮细胞和表皮杯状细胞分泌的表皮黏液也是鱼皮的重要成分，也是先天免疫系统的重要组成部分，其也可能作为丰富抗菌肽的重要来源[51]。表皮黏液中的抗菌肽的主要提取方法为化学法和蛋白酶酶解法，经凝胶过滤或离子交换、反相色谱进一步纯化后，可以得到对腐败希瓦氏菌和黄体微球菌等微生物具有抑制作用的抗菌肽[38，41]。

1.4 鱼内脏

内脏是鱼类低值副产物含量最高的，占鱼体总质量的12%～18%[52]。内脏中含有鱼鳔、鱼肠、精巢组织、鱼子与鱼油等，其是丰富的蛋白质来源，不仅可以用作动物饲料，而且可以作为生产脂肪酶与蛋白酶的原料[52]。关于从鱼类内脏中提取抗菌肽的研究较多，主要采用蛋白酶酶解与发酵法提取，Pezeshk 等[29]发现从黄鳍金枪鱼（Thunnusalbacores）内脏水解物中分离得到抗菌肽，可抑制鱼类腐败菌的生长。Ennaas 等[28]使用不同种类的商业酶水解大西洋鲭鱼（Scomberscombrus）的内脏，发现其粗水解产物对单增李斯特菌和大肠杆菌具有明显的抑制作用，同时，经过纯化后的组分可完全抑制上述2 种微生物的生长。

2 抗菌肽的提取与纯化

从鱼类低值副产物中提取抗菌肽的传统方法有化学水解（酸或碱水解）、酶水解、微生物发酵，虽然其都能有效促进抗菌肽的生产，但其各自都有优缺点，总结见表2。

表2 抗菌肽及生物活性肽的提取方法Table 2 Extraction methods of antimicrobial peptides and bioactive peptides

化学水解是通过使用酸或碱来切割肽键以产生多肽与游离氨基酸，虽然其价格低廉，操作简单，但是难以控制的水解过程，以及易破坏多肽结构与生物活性的缺点限制了其进一步的应用[20]。

酶水解是利用蛋白酶直接水解鱼类低值副产物来生产生物活性肽，由于其安全性高，水解条件温和，并且可以有针对性地以低成本生产特定的肽，成为使用最广泛的水解方法[19]。Robert 等[30]使用芽孢杆菌蛋白合物在50 ℃下水解罗非鱼（Oreochromisniloticus）副产物（头部、框架和内脏）30 min，发现其水解产物主要由多肽（46.9%）和寡肽（35.8%）组成，并对鲁氏耶尔森菌具有抗菌活性。由于选用来自微生物的蛋白酶制剂使得水解过程具有较高的成本[53]，因此Wald 等[31]通过使用从虹鳟鱼胃中分离纯化得到的胃蛋白酶水解虹鳟鱼的内脏，在37 ℃、pH2.0 的条件下进行水解，发现其水解产物对几种革兰氏阳性与阴性细菌皆有抗菌活性，且水解度对抗菌活性有很大的影响。

微生物发酵法是指利用产蛋白酶微生物发酵酶解鱼类低值副产物，其安全、环保、经济，是生产生物活性肽的另一种有效方法[25，54-55]。Song 等[42]通过混合微生物（施氏假单胞菌、漠海威芽孢杆菌、黑曲霉等）发酵棘头黄鱼（Collichthyslucidus）的副产物（内脏、头、尾和骨骼），并从其发酵产物中分离纯化出具有抗真菌活性的多肽，其可抑制植物病原菌的鼠疫菌属的生长。与酶水解相比，微生物发酵法由于多肽产量低以及多肽形成缺乏特异性，使得在工业上的开发受到阻碍[56]。

除了上述传统的方法，目前也有一些新的加工方法替代它们，如脉冲电场[57]与亚临界水萃取法[26，58]。脉冲电场是一种新型的非热技术，采用高强度脉冲电场通过去折叠、变性或凝胶化促进潜在生物活性肽的产生[26]。Franco 等[57]采用脉冲电场从鲷鱼与鲈鱼的副产物（鱼头、骨骼和鳃）中提取抗氧化剂，发现脉冲电场辅助水提取提高了提取物的抗氧化能力。亚临界水萃取被认为是一种很有前途的创新技术，是通过利用温度在100～374 ℃之间，压力低于22 MPa（低于水的临界点）的亚临界水水解蛋白质，其在较短的时间内以与酶水解相当的效率水解蛋白质[26，59]。Uddin 等[60]利用亚临界水萃取方法水解鱿鱼内脏，回收得到了一些有价值的产物，如氨基酸与还原糖。

经不同水解方法提取得到的一般为粗产物，需要进一步分离纯化。通常，首先通过膜过滤对水解产物进行初始分离，之后采用色谱方法进一步分离纯化，如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和反相高效液相色谱法[20]。研究发现通过膜超滤分离的黄鳍金枪鱼（Thunnusalb-acores）内脏水解液，其最低分子量（＜3 kDa）组分对单增李斯特菌具有更强的抗菌活性[29]。

3 抗菌活性检测方法

经提取、分离纯化后得到的多肽需进一步验证其抗菌活性，其主要评价方法有琼脂扩散试验（圆盘扩散分析）[36]、活细胞计数[27]、肉汤微量稀释[29]、高通量荧光筛选[61]，其各有优缺点，总结见表3。

表3 抗菌活性检测方法的优缺点Table 3 Advantages and disadvantages of detection methods of antibacterial activity

琼脂扩散试验与肉汤微量稀释法因具有简单方便的优点，是抗菌活性研究中常用的方法[62]。Ren 等[36]使用肉汤微量稀释法研究斑点叉尾鮰鱼骨蛋白酶解产物抗菌活性，结果发现鲶鱼骨酶解物对大肠杆菌的最小抑制浓度为6 mg/mL，并通过原子力显微镜与透射电镜发现其可通过损伤大肠杆菌细胞膜，导致细胞内容物的外泄，从而抑制并杀死大肠杆菌。由于部分真菌中菌丝体的存在，肉汤微量稀释法可能不太适用于对真菌的抗菌活性检测，而琼脂扩散试验相比肉汤微量稀释法更具适用性，且更直观。Song 等[42]利用琼脂扩散试验检测抗菌肽对鼠疫菌属抑制活性，发现在24.62 mg/mL 时即可形成明显的抑制圈。与活细胞计数相比，琼脂扩散试验是一种更为直观的抗菌活性检测方法，虽然操作简单，但其误差较大。Cheng 等[27]使用活细胞计数法检测了鲑鱼精蛋白对烟熏鲑鱼中单增李斯特氏菌的抑制活性，发现其在5 mg/g 浓度下即可延缓单增李斯特氏菌在烟熏鲑鱼上的生长。高通量荧光筛选法是一种快速且具有成本效益的荧光方法，Kodedová 等[61]利用其检测抗菌肽对念珠菌质膜的损伤，发现抗菌肽能够在15 min 内以较低浓度杀死细胞。

4 抗菌机制

抗菌肽是鱼类为抵御众多微生物感染的重要防御机制，虽然其结构具有多样性，但在本质上具有一定的共性[8]，如鱼皮中产生的Cathelicidins，具有典型的整体阳离子和两亲性的结构特性[63]；以及可能来源于鱼类各组织中的组蛋白衍生肽，其含有丰富的阳离子，同时具有α-螺旋与无规卷曲结构[64]；也还有一些未被深入研究的多肽，如从棘头黄鱼组织中得到的抗菌肽（氨基酸序列TFNTPAMYVAIQAVLSLYASGR），其可以抑制抗真菌的生长，被推测具有α-螺旋结构，C 端存在带正电荷的残基R，可能有助于通过静电相互作用与真菌细胞膜相互作用[42]。同时，鱼类中富含天冬氨酸和谷氨酸的一些非阳离子抗菌肽也相继被发现[65]。总体来说，抗菌肽的作用机制主要分为两种，一种为膜破坏机制，它们以特定的方式与带电的细胞膜结合，从而穿透膜或形成孔，最终导致微生物因细胞内容物的泄露而死亡，主要存在3 种模型解释这种作用机制，即桶栅模型、环孔模型和地毯模型[66]；另外一种是非膜破坏机制，它们可以通过跨膜易位后抑制重要的细胞过程，如核酸、蛋白质、肽聚糖的生物合成，从而起到杀死微生物细胞的作用[65]。目前，鱼源抗菌肽的抗菌机制研究更多的是其对细胞膜的作用[67]，如具有疏水或两亲性α-螺旋结构的Piscidins，是通过典型的环孔模型与细胞膜作用而发挥抑菌作用[68]。总之，与抗生素相比，抗菌肽能够极大程度地降低细菌耐药性的概率，同时，由于鱼类比哺乳动物更依赖其先天免疫防御，因此其也更有可能是对抗哺乳动物病毒感染的抗病毒化合物的潜在丰富来源[51]。