复合酶解提取牡蛎糖胺聚糖及其降血糖活性

王雅茹，陈晖，阎光宇，林河通，洪专，

（1.福建农林大学食品科学学院，福建 福州 350001；2.自然资源部第三海洋研究所海洋生物资源开发利用工程技术创新中心，福建 厦门 361005；3.厦门海洋职业技术学院，福建 厦门 361022）

牡蛎又称海蛎子、蚝或牡蛤，属软体动物门、双壳纲类牡蛎科。目前，有100 多种牡蛎分布在全球各大海域，我国牡蛎有20 余种，主要分布于福建、广东、山东等地，常见的品种有长牡蛎、褶牡蛎、福建牡蛎和近江牡蛎等[1]。牡蛎肉质鲜美，含有丰富的蛋白质、多糖、牛磺酸、多不饱和脂肪酸以及高于禽畜肉类含量的钙、铁、锌、硒，素有“海洋牛奶”、“海的玄米”之美誉[2-4]。据研究分析，干牡蛎肉中糖类化合物含量能够达到20%～40%，糖原能改善人的心脏及血液循环功能，增强肝脏功能，可直接被机体吸收利用，对糖尿病的防治十分有益[3]。

糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAGs）又称为酸性黏多糖，是一类由己糖醛酸和氨基糖重复单元构成的长线性杂多糖阴离子聚合物（硫酸角质素除外），以丝氨酸残基共价结合在核心蛋白上组合形成蛋白聚糖，结构复杂，具有极性和带负电荷的分子[5-6]。GAGs 主要分为肝素、硫酸乙酰肝素、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素和硫酸角质素等，对凝血、血糖、血栓形成、炎症、癌症、病毒感染和组织发育等具有重要影响[7-9]。GAGs 是贝类中的特征多糖之一，具有抗血栓[10]、抗病毒[11-13]、抗肿瘤[14-15]、抗氧化[16]、抗凝血[17]等多种生物活性。研究表明，贝类中提取的GAGs 能够通过抑制葡萄糖生成所需的α-葡萄糖苷酶的活性，达到抑制葡萄糖吸收、降低血糖的效果。孔艳等[18]从近江牡蛎中提取得到的GAGs 短时间内对α-葡萄糖苷酶抑制率效果优于阿卡波糖。宋佩林[19]从瘤背石磺贝类中提取的多糖浓度在0.05 mg/mL 时对α-葡萄糖苷酶抑制率可达到（82.2±3.3）%。此外，海洋来源的GAGs 不受陆源GAGs病原体污染，安全性高，具有开发成降血糖功能食品的潜力[20-21]。

目前，国内牡蛎产业中，养殖和粗加工占很大比例，产业化程度低、综合利用不充分等问题依然比较突出。因此，深入研究牡蛎蛋白类、糖类等活性物质的生理功能，进而开发出新型功能食品，对于发展牡蛎精深加工业，完善牡蛎的全产业链结构，具有积极的意义。本试验以福建牡蛎为原料，采用复合酶解法提取牡蛎中的GAGs，以牡蛎糖胺聚糖提取率为指标，通过单因素试验和响应面试验确定牡蛎糖胺聚糖最优提取工艺条件，并对获得的牡蛎糖胺聚糖进行成分分析和体外α-葡萄糖苷酶抑制活性评价，以期建立具有良好α-葡萄糖苷酶抑制活性的牡蛎糖胺聚糖提取方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

福建牡蛎：市售；胰蛋白酶（2 500 U/g）、碱性蛋白酶（20 万U/g）：南宁庞博生物工程有限公司；中性蛋白酶（20 万U/g）、木瓜蛋白酶（30 万U/g）、胃蛋白酶（20 万U/g）：南宁东恒华道生物科技有限责任公司；阿利新蓝8GX、硫酸软骨素：北京索莱宝科技有限公司；D-葡萄糖醛酸、α-葡萄糖苷酶（24.19 U/mg）、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer-ed solution，PBS）（0.1 mol/L，pH6.8）：上海源叶生物科技有限公司；考马斯亮蓝、牛血清蛋白标准品、硼酸、硫酸、磷酸、盐酸、无水乙醇、丙酮、硫酸钾、四硼酸钠、咔唑：西陇科学股份有限公司。以上试剂均为分析纯。

DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；Hei-VAP Value G3 旋转蒸发仪：德国Heidolph 公司；WF-20B 万能粉碎机：江阴市方圆机械制造有限公司；标准检验筛（80 目）：上虞市银河测试仪器厂；UH5300 紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；MULTISKAN Sky 全波长酶标仪：赛默飞世尔科技（中国）有限公司；890 TITRANDO 水分测定仪：瑞士万通中国有限公司；DZF6050 中型真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 材料预处理

新鲜福建牡蛎，经去壳、清洗、沥干、冻干、研磨成粉、过筛（80 目）后备用。

1.2.2 牡蛎糖胺聚糖提取工艺

准确称取10 g 牡蛎干粉，按料液比1∶15（g/mL）加水，混匀后按照设定的参数进行酶解提取，所得提取液经灭酶后，调节酶解液pH 值为2，离心除蛋白（10 000 r/min，10 min），取上清液将其pH 值调至7，旋转蒸发浓缩上清液至原体积的1/3，在60%乙醇4 ℃条件下沉淀24 h 后7 500 r/min 离心10 min 收集沉淀，分别用无水乙醇、丙酮洗涤2 次，于50 ℃真空干燥获得牡蛎糖胺聚糖。

1.2.3 单因素试验

按照1.2.2 的方法进行酶解提取，分别考察蛋白酶种类、2 种单一酶添加量、复合酶质量比、起始pH 值、复合酶添加量、酶解温度和酶解时间8 个单因素对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响。单因素试验梯度设置见表1。

1.2.4 响应面优化试验

基于单因素试验结果，以中性蛋白酶添加量（A）、胰蛋白酶添加量（B）、酶解温度（C）为考察因素，以牡蛎糖胺聚糖提取率为响应值，进行Box-Behnken 中心组合试验设计，并对试验获得的最优提取参数进行验证试验。响应面试验因素水平见表2。

表2 Box-Behnken 设计试验因素水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken design test

1.2.5 牡蛎糖胺聚糖主要成分分析

1.2.5.1 糖胺聚糖含量的测定

采用阿利新蓝比色法测定糖胺聚糖含量[22]。取质量浓度为0.1 mg/mL 的硫酸软骨素标准溶液0～0.8 mL，加超纯水至1 mL，加入1.5 mL 阿利新蓝染色液混匀，反应10 min，481 nm 处测定吸光度。以硫酸软骨素标准溶液的浓度为横坐标，吸光度A481nm为纵坐标绘制标准曲线：y=0.498 6x-0.015 1（R2=0.993 7）。将样品配制成1 mg/mL 溶液，参照上述方法测定样品的吸光度，根据标准曲线计算样品中糖胺聚糖含量。糖胺聚糖提取率（X，%）计算公式如下。

式中：m1为糖胺聚糖粗品质量，g；m2为原料质量，g；c为糖胺聚糖含量，%。

1.2.5.2 多糖测定

采用苯酚-硫酸法测定总糖含量[23]，以葡萄糖为对照品。

取6 支洁净试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶液，补纯水至1 mL；依次加入1 mL 5%苯酚、5 mL 浓硫酸，涡旋混匀，室温静置10 min，40 ℃水浴20 min，取出冷却至室温，用紫外分光光度计于490 nm 处测定吸光度；以葡萄糖标准品浓度为横坐标，吸光度A490nm为纵坐标，绘制标准曲线：y=10.496x+0.007 6（R2=0.995 3）。将样品配制成1 mg/mL 溶液，参照上述方法测定样品的吸光度，根据标准曲线计算样品中多糖含量。

1.2.5.3 糖醛酸含量测定

采用硫酸-咔唑法测定糖醛酸含量[24]，以葡萄糖醛酸为标准品。

取7 支洁净试管，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 的0.1 mg/mL 葡萄糖醛酸标准溶液，用纯水补至1.0 mL，冰水浴5 min；分别加入5.0 mL 12.5 mmol/L四硼酸钠-浓硫酸溶液，涡旋混匀，沸水浴15 min，取出后置于冰水浴中冷却至室温；再分别加入0.15%咔唑溶液0.2 mL，涡旋混匀，室温反应20 min，用紫外分光光度计于530 nm 处测定吸光度；以葡萄糖醛酸标准溶液浓度为横坐标，吸光度A530nm为纵坐标，绘制标准曲线：y=6.226x+0.026 9（R2=0.995 1）。将样品配制成1 mg/mL 溶液，参照上述方法测定样品的吸光度，根据标准曲线计算样品中糖醛酸含量。

1.2.5.4 蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[25]，以牛血清蛋白为标准品。

配制考马斯亮蓝溶液：准确称取考马斯亮蓝10 mg，依次加入90%乙醇5 mL、85%磷酸溶液10 mL 溶解，充分溶解后加入去离子水，抽滤2 次，定容至100 mL棕色容量瓶备用。

取7 支洁净试管，分别加入0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 标准品溶液，补去离子水至1.0 mL；加入考马斯亮蓝溶液5 mL 混匀，放置2 min，用紫外分光光度计于595 nm 处测定吸光度，以牛血清蛋白标准品溶液的浓度为横坐标，吸光度A595nm为纵坐标绘制标准曲线为y=0.006 8x+0.009 8（R2=0.992 4）。将样品配制成1 mg/mL 溶液，参照上述方法测定样品的吸光度，根据标准曲线计算样品中蛋白质含量。

1.2.5.5 灰分含量测定

参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》[26]的方法进行测定。

1.2.5.6 硫酸基含量测定

采用离子色谱法测定硫酸基含量[27]。色谱条件如下，色谱柱：Dionex IonPacTMAS 18 RFICTM 4 mm×250 mm；淋洗液：超纯水；流速：1.2 mL/min；检测器：电导检测器；抑制器电流：75 mA；柱温30 ℃；柱压：200～3 000 MPa；进样量：10 μL；检测时间：8 min。

配制50、100、150、200、250 μg/mL 浓度的硫酸根离子标准品溶液，进样分析，绘制峰面积-样品浓度标准曲线：y=0.059 8x+0.008 0（R2=0.997 1）。取1.2.5.5 中干法灰化至灰白色的样品，制成2.5 mg/mL 样品溶液进样分析，根据标准曲线计算样品中硫酸基的含量。

1.2.6 牡蛎糖胺聚糖α-葡萄糖苷酶活性抑制率测定

α-葡萄糖苷酶活性测定参考文献[28]的方法并加以修改，取一定量牡蛎糖胺聚糖粗制品，用0.1 mol/L PBS 缓冲溶液（pH6.8）配制成不同浓度的溶液（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），分别取上述不同浓度的样品溶液50 μL 于96 孔中，加入50 μL 5.0 mmol/L PNPG混匀后37 ℃下孵育10 min，再加入100 μL 0.1 U/mL 的α-葡萄糖苷酶溶液，于酶标板恒温37 ℃孵育20 min。以PBS 缓冲溶液（pH6.8）代替糖胺聚糖溶液作为空白组，PBS 缓冲溶液代替α-葡萄糖苷酶为样品对照组，于405 nm 波长处测定吸光度，分别为A样品、A空白和A样品对照。以阿卡波糖作为阳性对照，用同样方法测定阿卡波糖为样品的吸光度。通过以下公式计算样品与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制率（Y，%）。

1.3 数据分析

试验结果均以平均值±标准偏差表示（n=3）。采用Design-Expert 12.0 软件和IBM SPSS statistics 27.0 软件进行数据分析。运用Duncan 多重比较分析方法确定差异是否具有统计学意义；使用Origin 2021 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 牡蛎糖胺聚糖提取工艺单因素试验结果

2.1.1 蛋白酶的确定

5 种蛋白酶对牡蛎糖胺聚糖酶解效果的影响如表3所示。

表3 蛋白酶对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响Table 3 Effect of protease on the extraction rate of glycosaminoglycan in oyster

由表3 可知，5 种蛋白酶的糖胺聚糖提取率由大到小顺序为胰蛋白酶＞中性蛋白酶＞碱性蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞胃蛋白酶，胰蛋白酶和中性蛋白酶的提取率较高。胰蛋白酶属于肽链内切酶，可水解分子量较大的蛋白质，使其易与糖胺聚糖分离开；中性蛋白酶则能切断多肽的肽键，产生短肽和疏水性氨基酸，去除核心蛋白释放出糖胺聚糖。故本试验选择胰蛋白酶和中性蛋白酶复合酶解提取牡蛎糖胺聚糖。

2.1.2 单一酶添加量的确定

单一酶添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响如图1所示。

图1 单一酶添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响Fig.1 Effect of single enzyme addition on the extraction rate of glycosaminoglycan from oyster

由图1（a）可知，随着中性蛋白酶添加量增加，牡蛎糖胺聚糖提取率呈现先上升后下降趋势，当添加量为1.0%时，牡蛎糖胺聚糖提取率最高，达到0.27%，表明在此添加量下，中性蛋白酶酶解位点已达饱和，酶添加量过多会降低酶的作用效率，致使牡蛎糖胺聚糖提取率降低。由图1（b）可知，随着胰蛋白酶添加量的增加，牡蛎糖胺聚糖提取率呈逐渐上升趋势，当添加量为1.2%时提取率达到0.37%，之后牡蛎糖胺聚糖提取率几乎保持不变，差异不显著，表明在此添加量下，胰蛋白酶酶解位点达到饱和。从最少酶添加量和最大提取率两方面因素考虑，确定中性蛋白酶添加量1.0%、胰蛋白酶添加量1.2%较为适宜。

2.1.3 复合酶质量比的确定

中性蛋白酶与胰蛋白酶酶解的作用位点不同，采用双酶复合酶解，能够释放更多的糖胺聚糖，提高酶解程度。复合酶质量比对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响如图2所示。

由图2 可知，当复合酶添加总量固定时，随胰蛋白酶添加量的降低，糖胺聚糖提取率呈现先上升后下降的趋势。复合酶质量比为1∶1.20 时，酶解效果较好，糖胺聚糖提取率为0.41%。由于酶解反应的作用位点几乎饱和，继续增大中性蛋白酶添加量，糖胺聚糖提取率随之下降。因此确定中性蛋白酶和胰蛋白酶的质量比为1∶1.20。

2.1.4 起始pH 值的确定

起始pH 值对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响如图3所示。

图3 起始pH 值对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响Fig.3 Effect of initial pH on extraction rate of glycosaminoglycan from oyster

由图3 可知，当起始pH 值从6.5 上升至8.5 时，糖胺聚糖提取率逐渐上升后趋于平缓。当起始pH 值为8.0 时，提取率达到最高，为0.39%。这可能是由于中性蛋白酶和胰蛋白酶的最适pH 值为8.0 左右，当pH 值过低时不符合蛋白酶的最适pH 值，提取率较低；当pH 值过高时，可能会引起蛋白酶本身的变性，降低蛋白酶的活性。综上，确定酶解起始pH 值为8.0。

2.1.5 复合酶添加量的确定

在最优复合酶质量比1∶1.20 和最适pH 值的条件下，考察复合酶添加量对牡蛎糖胺聚糖提取效果的影响，结果如图4所示。

图4 复合酶添加量对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响Fig.4 Effects of compound enzyme supplementation on extraction rate of glycosaminoglycan from oyster

由图4 可知，随着复合酶添加量的增加，糖胺聚糖提取率逐渐上升，当添加量为2.20%时其提取率达到最大值0.42%，此后趋于平稳。这可能是由于随着复合酶添加量的提高，底物与酶位点的结合随之增加，酶解效果变好。但是当复合酶添加量继续增加时，由于底物与酶位点的结合趋于饱和，从而导致糖胺聚糖提取率不再上升，因此确定复合酶添加量为2.20%。

2.1.6 酶解时间的确定

酶解时间对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响如图5所示。

由图5 可知，随着酶解时间的延长，糖胺聚糖提取率逐渐升高，当酶解时间为4 h 时达到最高值0.48%，随后糖胺聚糖的提取率有所降低。表明牡蛎中的蛋白质需要完全水解，才能释放糖胺聚糖，而随着反应时间的不断延长，可能有部分糖胺聚糖降解导致提取率降低。由此确定酶解时间为4 h 最佳。

2.1.7 酶解温度的确定

酶解温度对牡蛎糖胺聚糖提取率的影响如图6所示。

由图6 可知，随着酶解温度由30 ℃上升至70 ℃，糖胺聚糖提取率先上升后下降，在50 ℃达到最高值0.54%。说明温度会直接影响酶活力，酶解温度过高会减弱蛋白酶的活性，影响酶解效果；适宜的酶解温度，有助于充分发挥蛋白酶的活性，提高糖胺聚糖提取率。由此选择酶解温度40、50、60 ℃进行响应面优化试验。

2.2 牡蛎糖胺聚糖提取工艺响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken 响应面试验结果

综合单因素试验结果，选择中性蛋白酶添加量（A）、胰蛋白酶添加量（B）、酶解温度（C）作为变量，以Design-Expert 12.0 软件设计中心组合试验，探究酶解的最佳条件，响应面试验结果见表4。

2.2.2 响应面试验方差分析

以糖胺聚糖提取率为响应值，利用Design-Expert 12.0 软件分析得到的二次多项式回归方程为Y=0.710 0-0.013 7A+0.091 3B-0.062 5C+0.022 5AB-0.015 0AC-0.015 0BC-0.061 3A2-0.181 3B2-0.158 7C2。

将上述二次回归方程进行方差分析检验，响应面回归系数模型及方差分析见表5。

表5 响应面回归系数模型及方差分析Table 5 Response surface regression coefficient model and variance analysis

由表5 可知，相关系数R2=0.979 6，R2Adj=0.953 4，且模型p值小于0.01，表明模型极显著，失拟项p值为0.125 8＞0.05（失拟项不显著），说明试验所得值与预测值相关性高，该模型的可信度和拟合度均高，可以用来分析和预测复合酶解法提取福建牡蛎糖胺聚糖的工艺条件。一次项B、C，二次项A2、B2、C2对结果有极显著影响（p＜0.01），一次项A与交互相AB、AC、BC均不显著（p＞0.05）。由F值可知，3 个因素对糖胺聚糖提取率影响的大小顺序为B＞C＞A。

因素间两两交互作用等高线及三维响应曲面如图7所示。

图7 因素间交互作用等高线图及三维响应曲面图Fig.7 Contour diagram and 3D response surface diagram of interaction between factors

由图7 可知，酶解温度的曲线最陡峭，等高线密集，其次是胰蛋白酶添加量，而中性蛋白酶添加量最平滑、稀疏，说明对结果影响大小的顺序为C>B>A，因素B和C的交互作用对结果影响最大，与方差结果分析一致。

2.2.3 最优提取工艺的确定及验证

利用响应面分析Design-Expert 12.0 软件分析得出复合酶解牡蛎糖胺聚糖的最佳工艺条件为中性蛋白酶添加量0.98%、胰蛋白酶添加量1.30%、酶解温度47.92 ℃、料液比1∶15（g/mL）、起始pH8.0 及酶解时间4 h，预测得到的提取率为0.72%。考虑到实际操作中的可行性，将工艺参数调整为中性蛋白酶添加量1.00%、胰蛋白酶添加量1.20%、酶解温度50 ℃、起始pH8.0、酶解时间4 h。在最优工艺条件下进行了3 组重复试验，所得到的牡蛎糖胺聚糖提取率为（0.71±0.12）%，与现有报道的波纹巴菲蛤糖胺聚糖提取率（0.413%）[29]较为接近，优于翡翠贻中糖胺聚糖提取率（0.255%）[30]，但低于鹿茸中糖胺聚糖提取率（2.89%）[31]。虽然牡蛎糖胺聚糖的提取率较低，但可与牡蛎肽等活性成分的开发形成联动，获得系列牡蛎功能产品，充分发掘、利用牡蛎资源。

2.3 牡蛎糖胺聚糖主要成分分析

对提取获得的糖胺聚糖粗制品进行了成分检测，结果见表6。

表6 牡蛎糖胺聚糖粗制品组成成分分析结果Table 6 Composition analysis results of oyster glycosaminoglycan coarse products

由表6 可知，牡蛎糖胺聚糖中糖胺聚糖含量为（14.32±0.32）%，糖醛酸含量为（17.08±1.16）%，多糖含量为（15.50±0.05）%，其余为蛋白质、无机盐等杂质。表明为得到较高纯度的糖胺聚糖，还需进一步精制纯化。

2.4 牡蛎糖胺聚糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制结果

对提取的牡蛎糖胺聚糖进行了α-葡萄糖苷酶活性抑制的研究，结果如图8所示。

图8 不同浓度的牡蛎糖胺聚糖与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制能力Fig.8 α-Glucosidase activity inhibition rates of oyster glycosaminoglycans and acarbose at different concentrations

由图8 可知，牡蛎糖胺聚糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制能力呈明显的量效关系，浓度在0.2～1.0 mg/mL时，随着糖胺聚糖浓度的增大，其对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用增强。当牡蛎糖胺聚糖粗提物配制浓度为1.0 mg/mL 时，对α-葡萄糖苷酶抑制率达到最大值42.65%，但仍弱于阿卡波糖（88.46%）。糖胺聚糖是天然杂多糖，其生物活性与其溶解性、空间构型、取代基、纯度等因素密切相关[8]，表明所得糖胺聚糖还需要进一步纯化，以提高对α-葡萄糖苷酶的抑制效果。

3 结论

本研究采用复合酶解的提取方法获得牡蛎糖胺聚糖，通过对中性蛋白酶添加量、胰蛋白酶添加量和酶解温度3 个因素进行优化，得到牡蛎糖胺聚糖复合酶解提取的最佳工艺条件为中性蛋白酶添加量1.00%、胰蛋白酶添加量1.20%、酶解温度50 ℃，此工艺条件下牡蛎糖胺聚糖提取率为（0.71±0.12）%，接近预测值0.72%。由此表明经过响应面设计法优化后的条件可用于牡蛎糖胺聚糖的提取工艺，为高效制备牡蛎糖胺聚糖提供了借鉴。通过对制备所得的牡蛎糖胺聚糖粗品进行成分检测，表明牡蛎糖胺聚糖中糖胺聚糖含量为（14.32±0.32）%，糖醛酸含量为（17.08±1.16）%，多糖含量为（15.50±0.05）%，其余为蛋白质、无机盐等杂质，需进一步精制纯化得到较高纯度的糖胺聚糖。采用PNPG 法，考察以阿卡波糖为阳性对照，对牡蛎糖胺聚糖的α-葡萄糖苷酶抑制能力进行测定，发现牡蛎糖胺聚糖浓度与α-葡萄糖苷酶活性的抑制率呈明显的量效关系，随着牡蛎糖胺聚糖浓度的增加，α-葡萄糖苷酶活性的抑制率逐渐增强；但其效果弱于阿卡波糖。牡蛎糖胺聚糖粗制品配制浓度为1.0 mg/mL 时，α-葡萄糖苷酶活性抑制率可达到42.65%，表明其具有一定的降血糖功效。通过进一步的精制纯化或结构改性，有望提高其生物活性，并进一步开发成功能食品。