1株寄生桑树的野生粗毛纤孔菌鉴定及资源特性分析

李剑梅，郭玲玲，柴林山，谢存一，张疏雨，朱万芹

（辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000）

粗毛纤孔菌（Inonotushispidus）俗称名粗毛黄孔菌或粗毛黄褐孔菌，属于担子菌门（Basidiomyeota）、伞菌纲（Agar ieomycetes）、锈革孔菌目（Hymenochaetales）、锈革孔菌科（Hymenochaetaceae）、纤孔菌属（Inonotus）[1-2]，主要寄生在榆树、桑树、桃树等阔叶树的树干上，在新疆南部以及山东“黄河故道”夏津、临清等地区一直将其当作“桑黄”并沿用至今[3]，为桑黄的一种，用于治疗癌症、糖尿病、通风、关节炎等疾病，是我国重要的药用真菌[4-5]。现代医学研究表明，粗毛纤孔菌的子实体含有丰富的多糖、多酚、黄酮、三萜类物质和其它活性物质[6-8]，具有抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗病毒、抗炎、活血化瘀、保肝、增强免疫力和抗氧化等多种功效，具有较高的营养价值，在多个领域都具有应用价值和开发潜能[9-13]。

近年来，粗毛纤孔菌的药用成分及其抗氧化能力引起了大量学者的关注。Liu 等[14]研究证明粗毛纤孔菌的多糖具有较好的抗氧化活性；昝立峰[15]从新疆南部桑树粗毛纤孔菌子实体中分离鉴定出的9 个多酚类物质中的桑黄酚可有效清除1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2，2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azinobis-（3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]阳离子自由基、羟自由基（·OH），具有良好的抗氧化活性；陈志娜等[16]研究发现粗毛纤孔菌醇提取物中的总多酚和总黄酮含量较高、抗氧化活性较强；李学震等[17]通过对6 个桑黄菌株的羟自由基清除率、DPPH 自由基清除率和总还原力进行评价，发现粗毛纤孔菌182有较强抗氧化能力。因此，粗毛纤孔菌是天然抗氧化剂的良好来源。但是，野生粗毛纤孔菌资源稀少，很难找到大量的子实体，且受季节限制，虽然已有成功栽培出粗毛纤孔菌子实体的相关研究[18]，但存在着出菇率和产量低、品质不稳定的技术难题，难以满足日益增长的市场需求。野生菌种质资源的收集和鉴定是粗毛纤孔菌产业发展的一项基础性研究工作，要推动珍稀药用真菌粗毛纤孔菌产业发展，必须创建和充分利用优质的种质资源库。但是，目前对粗毛纤孔菌种质资源的发掘和利用力度不足，亟需对优质野生粗毛纤孔菌种质资源开展野外调查、菌株采集、评价工作，为优质高效的粗毛纤孔菌菌种选育、驯化培养及应用提供丰富的种质资源。本研究以采集于辽宁省喀左县大营子乡活体桑树树干上的野生粗毛纤孔菌子实体为材料，分离获得纯培养菌株，进一步开展分类学鉴定、培养特性及抗氧化活性评价研究，以期为珍稀药用菌粗毛纤孔菌种质资源挖掘及其开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野生粗毛纤孔菌子实体：采集于辽宁省喀左县大营子乡活体桑树树干，采集时间为2022年8月，由辽宁省微生物科学研究院药用蕈菌研究室提供。

Ezup 柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；无水乙醇、碳酸钠、苯酚、浓硫酸、葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁（均为分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；总抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）测定试剂盒、DPPH自由基清除能力测定试剂盒、羟自由基清除能力测定试剂盒：苏州格锐思生物科技有限公司；没食子酸标准品（纯度98%）、葡萄糖标准品（纯度98%）、芦丁标准品（纯度98%）：上海麦克林生化科技有限公司；pH7.0 磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）：上海源叶生物科技有限公司。

马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）综合培养基：200 g 马铃薯，20 g 葡萄糖，3 g 蛋白胨，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，10 mg 维生素B1，15 g 琼脂粉，1 L 蒸馏水，pH6.0。

基础培养基：200 g 马铃薯，3 g KH2PO4，1.5 g MgSO4·7H2O，10 mg 维生素B1，15 g 琼脂粉，1 L 蒸馏水，pH6.0。

1.2 仪器与设备

LDZX-75KBS 立式压力蒸汽消毒器：上海申安医疗器械厂；SW-CJ-2FD（标准型）双人单面净化工作台：常州博莱尔净化设备有限公司；DHP-PZ72 型电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；OLYMPUS生物显微镜：上海通灏光电科技有限公司；2720 thermal cycler 聚合酶链反应核酸扩增仪（polymerase chain reaction，PCR）：美国Applied Biosystems 公司；DYY-5电泳仪：北京市六一仪器厂；723N 型可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；PR224ZH/E 型电子天平：奥豪斯（上海）仪器有限公司；HH-2 型数显恒温水浴锅：常州市江南实验仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 菌株分离纯化方法

采用组织分离法，将采集的子实体用75%酒精消毒表面，用无菌手术刀纵向切开，用接种针挑取子实体纵切面中心位置的菌块置于PDA 综合培养基表面，在25 ℃的环境中避光培养，待菌丝萌发后，挑取菌落边缘新生菌丝于新的PDA 综合培养基上进行纯化培养，反复纯化培养3 次后，获得野生粗毛纤孔菌的纯培养菌株，编号SK-4。

1.3.2 物种鉴定

1.3.2.1 形态学鉴定

结合表观形态及显微形态特征完成样本形态学初步鉴定。利用解剖镜和显微镜观察子实体及孢子形态特征，同时无菌挑取供试菌株新鲜斜面培养物置于预制好的PDA 综合培养基上，25 ℃恒温培养，观察菌落形状，挑取菌落的菌丝，压片后置于光学显微镜下观察菌丝形态。

1.3.2.2 分子鉴定

将供试菌株接种至PDA 综合培养基上，在25 ℃的环境中避光倒置培养，待菌丝长满后取适量菌丝，利用真菌基因组提取试剂盒提取其DNA；利用通用引物内部转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）1 和ITS4 进行ITS 片段扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物后，将PCR 产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。结合所得序列和GenBank 下载的相关序列，运用ClustalX 1.81 进行多重序列比对，利用MEGA 3.1 的邻接法（N-J）构建系统发育进化树。

1.3.3 培养特性研究

1.3.3.1 碳源对菌丝生长的影响

以基础培养基为对照，其他培养基分别以蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露醇、麦芽糖为碳源。将直径5 mm 供试菌株的菌块接种至预先制备好的供试培养基中央，于25 ℃的环境中避光、倒置培养。采用十字交叉法测定菌落直径，并记录菌丝生长情况，确定最适碳源。

1.3.3.2 氮源对菌丝生长的影响

以基础培养基为对照，其他培养基分别以牛肉膏、蛋白胨、乙酸铵、硫酸铵、酵母粉为氮源。接种、培养及测量方法同1.3.3.1，确定最适氮源。

1.3.3.3 pH 值对菌丝生长的影响

采用PDA 综合培养基，用0.01 mol/L 的HCl 和NaOH 溶液调节PDA 综合培养基初始pH 值分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0。接种、培养及测量方法同1.3.3.1，确定培养基最适初始pH 值。

1.3.3.4 培养温度对菌丝生长的影响

采用PDA 综合培养基，接种后分别置于19、22、25、28、31、35 ℃环境中避光培养。接种、培养及测量方法同1.3.3.1，确定最适培养温度。

1.3.4 子实体抗氧化活性评价

1.3.4.1 子实体活性成分提取

以试剂残留少、毒性低的水及70%乙醇为提取溶剂，准确称取粗毛纤孔菌子实体粉末0.500 0 g 共2 份于50 mL 磨口三角瓶中，分别加入20 mL 蒸馏水及70%乙醇，在50 Hz、60 ℃条件下回流超声辅助提取2 h，分别用蒸馏水及70%乙醇定容至25 mL，于15 ℃、5 000 r/min条件下离心20 min，收集上清液，即可获得桑黄子实体水提、醇提供试样品溶液，于4 ℃保存，备用。

1.3.4.2 多酚含量测定

参照邓真华等[19]的测定方法，以没食子酸质量浓度为横坐标，以对应的A750吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程为y=4.168x-0.008，R2=0.993 0。于750 nm 处分别测定不同条件下获得的子实体提取液的吸光值，按照标准曲线方程计算供试样品液中多酚的浓度，并换算成每克子实体相对于没食子酸的量（mg/g）。

1.3.4.3 黄酮含量测定

采用亚硝酸钠-硝酸铝法，按照龙华等[20]的测定方法，稍作修改。准确吸取0.2 mg/mL 芦丁标准溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于25 mL 比色管中，分别加70%乙醇至5.0 mL；加入5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min；加入10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，静置6 min；加入4%NaOH 溶液10 mL，放置10 min 后用70%乙醇定容至25 mL，510 nm 下测定吸光值。以芦丁质量浓度为横坐标，以对应吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程为y=2.536 7x-0.000 4，R2=0.999 7。准确吸取不同条件获得的粗毛纤孔菌子实体提取液3.0 mL 于25 mL 比色管中，同法测定供试样品液的吸光值，按照标准曲线方程计算供试样品液中黄酮的浓度，并换算成每克子实体相对于芦丁的量（mg/g）。

1.3.4.4 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法，按照余丽等[21]的测定方法。以葡萄糖质量浓度为横坐标，以对应的A490吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性回归方程为y=12.274x+0.01，R2=0.999 1，于490 nm 处分别测定不同条件获得的粗毛纤孔菌子实体提取液的吸光值，按照标准曲线方程计算供试样品液中多糖的浓度，并换算成每克子实体相对于葡萄糖的量（mg/g）。

1.3.4.5 总抗氧化能力测定

采用Trolox 等效总抗氧化能力评价方法，使用总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（ABTS 法）对子实体不同提取液进行测试分析，测试步骤参考试剂盒说明书，按照公式（1）计算供试样品总抗氧化能力。

式中：M为总抗氧化能力，μmol Trolox/g；△A为吸光值差值；A测定为样品ABTS 的吸光值；A对照为样品与PBS 混合液吸光值；A空白为ABTS 工作液与PBS 混合液的吸光值；D为样品的稀释倍数；W为样品的质量，g。

1.3.4.6 DPPH 自由基清除率测定

利用DPPH 自由基清除能力测定试剂盒进行测试分析，测试步骤参考试剂盒说明书，按照公式（2）计算供试样品液的DPPH 自由基清除率，按照公式（3）计算供试样品的DPPH 自由基的清除能力。

式中：M1为DPPH 自由基清除率，%；M2为DPPH自由基清除能力，mg Trolox/g；A测定为样品与DPPH 混合液吸光值；A对照为样品与无水乙醇混合液吸光值；A空白为DPPH 与无水乙醇混合液吸光值；D为样品的稀释倍数；W为样品的质量，g。

1.3.4.7 羟自由基清除率测定

利用羟自由基清除能力测定试剂盒进行测试分析，测试步骤参考试剂盒说明书，按照公式（4）计算供试样品的羟自由基清除率。

式中：N为羟自由基清除率，%；A测定为测定管的吸光值；A对照为对照管的吸光值；A空白为空白管的吸光值。

1.4 数据处理

使用软件Excel 2007、IBM SPSS Statistics25 对数据进行统计分析和处理，结果以平均值±标准差表示，试验重复3 次。

2 结果与分析

2.1 鉴定结果

2.1.1 形态学鉴定结果

SK-4 菌株子实体、菌落及菌丝体形态见图1。

图1 SK-4 菌株形态特征Fig.1 Morphological characteristics of SK-4 strain

由图1 可知，试验菌株子实体平展至半圆形，无柄，木栓质，新生子实体表面光滑、呈淡黄色；成熟子实体表面覆盖着粗毛、呈黄褐色至暗褐色，菌盖边缘顿，菌管管口多角形，较菌肉色泽浅；担孢子呈椭圆形，表面光滑，金黄色，有明显厚壁；在PDA 综合培养基上，以接种块为中心呈辐射状扩张生长，菌丝初期为白色绒毛状，后逐渐变为较暗的浅黄褐色，边缘为白色细微菌丝，菌丝有分枝和分隔，老熟菌丝呈淡黄色，无锁状联合。这些特征与郭春宣等[22]描述的粗毛纤孔菌形态特征一致。

2.1.2 分子鉴定

经过对SK-4 菌株ITS 序列的测定及生物大分子序列比对搜索工具比对，发现SK-4 菌株ITS 序列的长度为738 bp，与粗毛纤孔菌MZ467700.1、MN699465.1 ITS 序列的相似度达到了99%以上，显示较高的同源性比对结果。从美国国家生物技术信息中心选取与SK-4 菌株同源性较高的菌株及在分类上易与粗毛纤孔菌混淆的桑黄菌属模式菌种的ITS 序列，采用邻接法构建系统发育进化树，结果如图2所示。

图2 基于ITS 序列构建的系统发育进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由图2 可知，SK-4 菌株与GenBank 中的3 株粗毛纤孔菌InonotushispidusITS 片段聚在一个高支持率的独立支系，亲缘关系较近，尤其是与粗毛纤孔菌MZ467700.1、MN699465.1 的亲缘关系最近，属于同一个物种，进一步证实了SK-4 菌株为粗毛纤孔菌，该结果与子实体形态鉴定结果一致。结合形态鉴定和分子生物学结果，将采集的菌株鉴定为粗毛纤孔菌Inonotushispidus。

2.2 生物学特性试验结果

2.2.1 碳源对菌丝生长的影响

不同碳源对试验菌株菌丝生长的影响结果见表1。

表1 不同碳源对SK-4 菌株菌丝生长的影响Table 1 Effects of different carbon sources on the mycelium of SK-4 strain

由表1 可知，试验范围内，SK-4 菌株在不同碳源培养基上的生长情况存在明显差异。在菌丝生长速度方面，供试菌株菌丝的生长速度由快到慢依次为蔗糖＞甘露醇＞乳糖＞麦芽糖＞葡萄糖；在菌丝长势方面，相比其它碳源培养基，SK-4 菌株在蔗糖培养基上长势最佳，菌落黄褐色、边缘整齐、致密毯状、菌丝浓密旺盛；葡萄糖培养基次之，甘露醇培养基上菌丝长势最差，菌落边缘不整齐、菌丝较细弱稀疏；无碳源的对照培养基菌丝也能萌发生长，菌丝生长速度为1.93 mm/d，明显低于葡萄糖培养基，菌丝长势较甘露醇培养基更为细弱稀疏。由此可见，碳源是菌丝生长的重要营养成分，培养基中添加不同的碳源对SK-4 菌株菌丝生长具有明显的促进作用，综合菌丝长势和菌丝生长速度，SK-4 菌株生长的最适碳源为蔗糖。

2.2.2 氮源对菌丝生长的影响

不同氮源对试验菌株菌丝生长的影响结果见表2。

表2 不同氮源对SK-4 菌株菌丝生长的影响Table 2 Effects of the different nitrogen sources on the mycelium of SK-4 strain

由表2 可知，试验范围内，不同的氮源对SK-4菌株菌丝的生长影响显著。氮源为酵母粉、硫酸铵培养基中试验菌株菌丝的生长速度相近，分别为2.51、2.58 mm/d，明显优于其它氮源培养基，其次为无氮源对照、蛋白胨、乙酸铵、牛肉膏培养基。酵母粉为氮源培养基上的菌丝长势最好，菌落呈浅黄褐色，菌丝浓密健壮，菌落呈致密毯状、边缘整齐；硫酸铵培养基次之，菌丝较为浓密健壮、菌落边缘整齐；牛肉膏、蛋白胨为氮源培养基上的菌丝较为稀疏，菌落边缘不整齐；乙酸铵培养基上的菌丝长势最差，菌落中心略显淡黄色，菌落周边白色菌丝气生性强，且细弱稀疏；无氮源对照培养基上的菌丝生长速度（1.93 mm/d）介于硫酸铵（2.58 mm/d）和蛋白胨（1.66 mm/d）培养基之间，菌丝较为细弱稀疏，说明酵母粉、硫酸铵对试验菌株菌丝的生长具有显著的促进作用。综合菌丝长势和菌丝生长速度，SK-4 菌株生长的最适氮源为酵母粉。

2.2.3 pH 值对菌丝生长的影响

不同pH 值对试验菌株菌丝生长的影响见表3。

表3 pH 值对SK-4 菌株菌丝生长的影响Table 3 Effects of different pH on the mycelium of SK-4 strain

由表3 可知，在试验范围内，SK-4 菌株在酸度较强的pH3.0 培养基上停止生长，但在pH4.0～9.0 条件下均能生长，除在pH4.0 菌丝生长缓慢、长势细弱外，在pH 值为5.0～9.0 时菌丝生长情况均较好，说明SK-4菌株能较好地适应pH 值为5.0～9.0 的环境；当培养基初始pH 值为5.0、5.5 时，菌丝生长速度达到较高水平，分别为2.50、2.27 mm/d，明显优于其它处理，pH5.0菌丝生长速度最快。因此，SK-4 菌株菌丝生长最适pH值为5.0。

2.2.4 培养温度对菌丝生长的影响

不同培养温度对试验菌株菌丝生长的影响结果见表4。

培养温度的变化对食用菌菌株的影响较大，培养温度过高或过低均不利于其生长繁殖。由表4 可知，试验范围内，SK-4 菌株的菌丝生长速度随培养温度升高逐渐加快，菌丝的长势也随着培养温度的升高而逐步改善，当培养温度达到25～28 ℃时，菌丝生长速度为2.52～2.56 mm/d，菌丝生长速度相对稳定，并且达到了较高水平，此时菌丝长势也最为浓密、旺盛；随着培养温度的升高，菌丝生长受到抑制，菌丝长势变弱、生长速度减慢。由此可见，SK-4 菌株最适生长温度为25～28 ℃。

2.3 抗氧化活性评价结果

2.3.1 主要活性成分含量及抗氧化活性

SK-4 菌株子实体活性成分含量分析及抗氧化活性测试结果见表5。

表5 子实体不同提取物的主要活性成分含量及抗氧化活性Table 5 Content of active components and antioxidant activity of the fruiting body extracts prepared with different solvents

由表5 可知，SK-4 菌株子实体含有丰富的黄酮、多酚及多糖成分，不同提取溶剂所获提取物中黄酮、多酚、多糖的含量存在明显差异。其中，子实体70%乙醇提物中黄酮、多酚的含量明显高于水提物，其黄酮、多酚含量分别是水提物的1.13、1.28 倍，而子实体多糖主要存在于水提物中，水提物中多糖的含量是醇提物多糖含量的1.99 倍，明显高于醇提物，说明SK-4 菌株子实体多糖主要为水溶性多糖，而70%乙醇溶液更有利于提取SK-4 菌株子实体酚类化合物。试验范围内，供试菌株子实体70%乙醇提取物的DPPH自由基清除能力（5.83 mg Trolox/g）虽略低于水提物（6.29 mg Trolox/g），但总抗氧化能力（70.98 μmol Trolox/g）是水提物（45.56 μmol Trolox/g）的1.56 倍，同时其醇提物具有羟自由基清除能力，未检测到水提物羟自由基清除能力，可见试验菌株子实体不同提取物均具有一定的抗氧化活性，其中子实体70%乙醇提取物的抗氧化活性明显优于水提物。

2.3.2 抗氧化活性与主要活性成分含量相关性分析

抗氧化活性与主要活性成分含量相关性分析结果见表6。

表6 子实体不同提取物的抗氧化活性与活性成分相关性分析Table 6 Correlation coefficients of antioxidant activity with the active component content in fruiting bodies

由表6 可知，试验范围内，供试菌株子实体总抗氧化能力、羟自由基清除率与多酚和黄酮的含量呈线性正相关（P＜0.01），相关系数均大于0.95，与DPPH 自由基清除能力呈一定的负相关关系；多糖含量与DPPH自由基清除能力相关系数为0.557，呈中等的正相关，与总抗氧化能力、羟自由基清除率呈极显著负相关（P＜0.01）。说明黄酮及多酚是粗毛纤孔菌SK-4 总抗氧化能力、羟自由基清除能力的关键物质，而多糖是其DPPH自由基清除能力的主要活性成分。

3 结论

试验以寄生在活体桑树上的粗毛纤孔菌子实体为材料，通过菌种的分离、纯化，获得纯培养菌株SK-4，并通过形态特性观察、ITS 序列分析及系统发育进化树的构建将其鉴定为粗毛纤孔菌Inonotushispidus。培养特性试验结果显示：试验范围内，寄生在活体桑树上的野生菌株SK-4 菌丝生长的最适碳源和氮源分别为蔗糖和酵母粉，最适pH 值为5.0，最适培养温度为25～28 ℃。野生菌种资源是粗毛纤孔菌优质高效生产菌种选育的重要来源，但由于生长环境条件及菌种种性的差异，其菌丝体生长发育所需营养条件、培养温度、pH 值等培养条件有所不同，故加强野生菌种质资源采集、鉴定及培养特性研究，对丰富粗毛纤孔菌菌种资源及粗毛纤孔菌株SK-4 人工驯化培养具有重要意义。

在探究SK-4 菌株生物学特性基础上，以试剂残留少、毒性低的水及70%乙醇为提取溶剂，进一步研究了野生粗毛纤孔菌SK-4 子实体主要活性成分的含量及体外抗氧化活性。结果表明，子实体70%乙醇提取物具有总抗氧化能力、DPPH 自由基清除能力、羟自由基清除能力3 个体系的抗氧化活性，抗氧化活性明显优于水提物，特别是总抗氧化能力达到了水提物的1.56 倍；SK-4 菌株子实体的水提物及醇提物均含有丰富的多糖、黄酮及多酚成分，其子实体多糖主要存在水提物中，水提物中多糖的含量是醇提物多糖含量的1.99 倍，且其多糖含量与DPPH 自由基清除能力呈中等正相关（R2=0.557），与总抗氧化能力、羟自由基清除率呈负相关；70%乙醇溶液有利于黄酮、多酚的提取，黄酮、多酚含量分别是水提物的1.13、1.28 倍，二者的含量与总抗氧化能力、羟自由基清除率呈极显著正相关（R2＞0.95），与DPPH 自由基清除能力呈负相关。这一研究结果说明了SK-4 菌株子实体多糖成分是其清除DPPH 自由基的主要活性成分，而其子实体中的黄酮、多酚对粗毛纤孔菌SK-4 抗氧化活性起到了关键作用。本研究为粗毛纤孔菌SK-4 菌株子实体中抗氧化活性成分提取及开发利用提供了科学依据。