肉瘤组织中COL6A1基因的表达水平及其意义

胡伟全 赵琴飞 朱龙玉 胡素萍 陈芳芳

(1 赣州市人民医院关节外科,江西 赣州 341000; 2 赣南医学院第一附属医院检验科; 3 河北医科大学第四医院放疗科;4 赣南医学院第一附属医院急诊科; 5 东部战区总医院检验医学研究所基础医学实验室)

肉瘤是一种间充质来源的异质性恶性肿瘤,比较罕见,约占所有儿童恶性肿瘤的21%,所有成人恶性肿瘤的1%[1]。目前已鉴定出100多种不同的肉瘤实体,大致分为软组织肉瘤和骨肉瘤[2-3]。目前肉瘤的标准治疗方案主要有手术切除、化学疗法和放射疗法,但近几年来患者的疗效和预后并没有显著提高[4]。Ⅵ型胶原A(COL6A)是蛋白质超家族中的一员,由3条主要的多肽链(α1、α2和α3)组成,是主要的细胞外基质之一[5]。研究发现,在宫颈癌、前列腺癌、肺癌以及胰腺癌等肿瘤组织中COL6A1基因呈显著高表达,并且与肿瘤进展密切相关[6-9],但COL6A1基因在肉瘤组织中的表达水平及其作用机制尚未见相关研究报道。本研究旨在通过生物信息学方法分析COL6A1基因在肉瘤发生发展及预后中的作用及其机制,为肉瘤患者的治疗提供参考依据。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 GEO数据库不同类型肉瘤组织中COL6A1～3基因表达水平

在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)选取并下载骨肉瘤数据集GSE16088[10]、软组织肉瘤数据集GSE21122[11]和肾透明细胞肉瘤数据集GSE49972[12]的原始测序数据,用R软件Limma软件包对数据标准化后,分析骨肉瘤、软组织肉瘤和肾透明细胞肉瘤组织中COL6A1～3基因表达水平。肉瘤组织和正常组织中差异基因比较用Wilcoxon检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

1.2 肉瘤组织中COL6A1～3基因的表达水平与患者的生存、免疫细胞浸润的相关性分析

从TCGA数据库(https://genome-cancer.ucsc.edu/)中下载肉瘤组织以及正常组织样本的转录组RNAseq数据和患者的生存数据。采用R软件的survival包分析肉瘤组织中COL6A1～3基因的表达水平与患者生存的相关性,并通过survminer包绘制患者的Kaplan-Meier(KM)生存曲线[13],并进行Log-rank检验,以P<0.05为差异具有统计学意义。采用GSVA包[14]对肉瘤组织中COL6A1基因的表达水平与24种免疫细胞[15]浸润之间的相关性进行Spearman相关性分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

1.3 肉瘤组织中与COL6A1共表达基因的分析以及COL6A1和COL6A2基因表达的相关性分析

通过LinkedOmics数据库(http://www.linkedomics.org/login.php)[16]分析肉瘤组织当中与COL6A1存在相关性的其他差异表达的基因,即COL6A1的共表达基因,分析结果以皮尔逊相关系数表示。通过R软件的ggstatsplot包对肉瘤组织中COL6A1和COL6A2基因表达的相关性进行Spearman分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

1.4 肉瘤组织中COL6A1共表达基因的GO功能富集分析和KEGG通路分析

使用R软件的clusterProfiler包对与COL6A1共表达基因进行GO功能富集分析和KEGG通路分析[17]。

1.5 肉瘤组织当中COL6A1共表达基因的激酶、miRNA及转录因子靶标分析

在分子特征数据库当中[18]使用GSEA分析COL6A1共表达基因的激酶、miRNA及转录因子靶标,等级标准参数即错误检测率(FDR)<0.05,且进行了500次模拟。

2 结 果

2.1 不同类型肉瘤组织中COL6A1～3基因的表达水平

GEO数据库分析结果显示,与正常组织相比,骨肉瘤和软组织肉瘤组织中COL6A1～3基因的表达水平均显著升高(t=2.68～7.98,P<0.05),肾透明细胞肉瘤组织当中COL6A1以及COL6A2基因的表达水平亦显著升高(t=2.95、2.80,P<0.05),COL6A3表达水平无显著差异(P>0.05)。

2.2 肉瘤组织中COL6A1～3基因的表达水平与预后的相关性分析

KM生存曲线分析结果显示,肉瘤组织当中COL6A1基因表达水平与患者的总体生存率(OS)和疾病特异生存率(DSS)有关(χ2=6.37、4.57,P<0.05),详见图1A、B;肉瘤组织当中COL6A2以及COL6A3的高表达与患者的OS和DSS无显著相关性(P>0.05)。

A、B分别为肉瘤组织中COL6A1基因表达水平与患者的OS、DSS的KM生存曲线

2.3 肉瘤组织中COL6A1基因的表达水平与免疫细胞浸润的相关性

GSVA包分析结果显示,肉瘤组织中COL6A1基因的表达水平与中性粒细胞、辅助性T细胞2和成熟树突状细胞浸润存在显著正相关(r=0.240～0.280,P<0.05)。

2.4 肉瘤组织中与COL6A1共表达基因分析以及COL6A1和COL6A2基因表达的相关性分析

在LinkedOmics数据库中,分析肉瘤组织当中与COL6A1共表达的基因情况,分析结果显示,与COL6A1表达水平显著正相关的基因2 444个,与COL6A1表达水平显著负相关的基因有3 711个(FDR<0.05),图2A、B分别显示了与COL6A1呈现显著正相关和负相关的前50个基因,其中红色表示了高表达基因,蓝色表示低表达基因。R软件的ggstatsplot包进一步分析结果显示,肉瘤组织当中COL6A1和COL6A2的表达呈显著正相关性(r=0.830,P<0.05)。

a:与COL6A1正相关的前50个基因热图,B:与COL6A1负相关的前50个基因热图

2.5 肉瘤组织中与COL6A1共表达基因的GO功能富集分析和KEGG通路分析

GO功能富集分析结果显示,与COL6A1相关的共表达基因主要位于突触前、神经元细胞体和细胞-基质连接等成分中,主要参与多细胞生物体内平衡、中性粒细胞介导的免疫反应、中性粒细胞参与的活化免疫反应等生物学过程。KEGG通路分析结果显示,这些基因主要在PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染、神经元活性配体-受体相互作用和MAPK信号通路中富集。

2.6 肉瘤组织当中COL6A1共表达基因的激酶、miRNA及转录因子靶标分析

肉瘤组织中与COL6A1共表达基因的GSEA分析结果显示,与COL6A1共表达基因相互作用的5个最重要的激酶靶标是PRKCA、SRC、LYN、PRKAA1和PAK1; 重要的miRNA靶标是miR-506、miR-200B、miR-200C、miR-429和miR-330;重要转录因子靶标是V$ETS2_B、V$AP1_C、V$PU1_Q6、V$RORA1_01和V$AP1_Q2。

3 讨 论

肉瘤是相对罕见的异质性恶性肿瘤,患者死亡率极高[19],目前的治疗方法主要还是手术切除、放疗和化疗,患者的预后很差[20]。因此迫切需要深入探讨肉瘤发病的分子机制,挖掘其有效的预后和治疗靶点。

COL6A1是脊椎动物中的保守基因,几乎存在于机体内的所有结缔组织当中,以维持组织的完整性[21]。研究发现,肿瘤组织中COL6A1的高表达与肿瘤进展密切相关[22]。COL6A1还被发现参与多种肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移过程[9,23]。此外,前列腺癌细胞系中COL6A1基因敲减以后会通过JK-STAT途径抑制前列腺癌细胞的增殖[7]。目前关于COL6A1在肉瘤组织中的表达情况及其作用机制尚不清楚。

本研究首先通过在GEO数据库的GSE16088、GSE21122和GSE49972数据集中对肉瘤组织和正常组织中的COL6A1～3基因表达进行差异分析,结果显示,与正常组织相比,COL6A1基因在骨肉瘤、软组织肉瘤和肾透明细胞肉瘤等组织中的表达水平均显著升高。进一步KM生存曲线分析显示,肉瘤组织中COL6A1基因高表达的患者,预后更差。以上结果表明,COL6A1可能在肉瘤的发生发展中具有重要作用。

为进一步了解COL6A1共表达基因在肉瘤中的作用机制,本研究对肉瘤组织中COL6A1共表达基因进行了GO功能富集分析和KEGG通路分析。GO功能富集分析结果显示,肉瘤组织中COL6A1共表达基因主要参与多细胞生物体内平衡、中性粒细胞介导的免疫反应和中性粒细胞参与的活化免疫反应等生物学过程。免疫细胞浸润相关性分析同样表明,肉瘤组织中COL6A1基因的表达水平与中性粒细胞的细胞浸润水平之间存在显著相关性。这表明COL6A1表达可能主要通过影响肿瘤微环境中的免疫浸润,尤其是中性粒细胞的细胞浸润,进而影响患者的预后和生存。在过去的几年中,越来越多的证据表明免疫系统在肿瘤的控制和进展中起着重要作用[24]。免疫疗法在某些类型的肿瘤,例如非小细胞肺癌以及黑素瘤的治疗当中获得了喜人的结果[25],本研究结果可能对肉瘤的免疫治疗具有一定的意义。此外,本研究KEGG通路分析显示,肉瘤组织中COL6A1共表达基因主要富集于PI3K-Akt信号通路、人乳头瘤病毒感染、神经元活性配体-受体相互作用以及MAPK信号通路中,因此这些基因表达水平的变化可能与肉瘤的发生发展具有重要的关系。

本研究通过GSEA分析肉瘤组织中COL6A1共表达基因的重要激酶、miRNA及转录因子靶标,以进一步揭示COL6A1在肉瘤中的作用机制。本研究结果显示,与COL6A1共表达基因相互作用的5个最重要的激酶靶标是PRKCA、SRC、LYN、PRKAA1、和PAK1;重要的miRNA靶标是miR-506、miR-200B、miR-200C、miR-429和miR-330;重要转录因子靶标是V$ETS2_B、V$AP1_C、V$PU1_Q6、V$RORA1_01和V$AP1_Q2。然而这些激酶、miRNA及转录因子调控机制比较复杂,需要进一步实验验证,以期为临床治疗提供重要指导。虽然LinkedOmics数据库的共表达分析以及R软件ggstatsplot包的相关性分析均表明COL6A1和COL6A2之间呈显著正相关,COL6A家族成员之间的相互作用及其具体的分子机制也仍有待进一步研究。

综上所述,本研究通过对多个数据库当中肉瘤患者的RNA测序数据进行生物信息学分析提示,COL6A1基因在肉瘤组织中显著高表达,COL6A1基因的高表达也与肉瘤患者的不良预后密切相关,COL6A1可能是肉瘤的一个有价值的预后指标和潜在的治疗靶点。本研究可为肉瘤患者的预后及治疗提供新的思路和理论依据。

作者声明：胡伟全、赵琴飞、陈芳芳参与了研究设计;胡伟全、赵琴飞、朱龙玉、胡素萍、陈芳芳参与了论文的写作和修改。所有作者均阅读并同意发表该论文,且均声明不存在利益冲突。