膀胱癌相关lncRNA及其共表达mRNA的初步筛选与功能预测

舒静，黄梦鸽，田强，姜源，陈俊霞

(1西南医科大学附属医院，四川泸州 646000；2重庆医科大学)

膀胱癌相关lncRNA及其共表达mRNA的初步筛选与功能预测

舒静1，黄梦鸽1，田强1，姜源1，陈俊霞2

(1西南医科大学附属医院，四川泸州 646000；2重庆医科大学)

目的 筛选出在膀胱癌组织中特异性表达的长链非编码RNA(lncRNA)及其共表达mRNA，并进行初步验证及功能预测。方法 采用lncRNA v4.0芯片筛选4对膀胱癌和癌旁组织中lncRNA及其共表达mRNA的差异表达谱，通过聚类分析比较二者表达差异；采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法对5个异常调节的lncRNA(RP11-359E19.2、AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3、AK021804)和4个共表达的mRNA(HRAS、VEGFA、ITGB1、DNMT3B)进行验证。同时，对lncRNA共表达的mRNA进行GO及KEGG pathway富集分析。结果 差异表达的lncRNA共4 155条，其中2 045条高表达、2 110条低表达；与lncRNA共表达的mRNA共4 416条，其中2 472条高表达、1 944条低表达。|FC|≥10的lncRNA 345条，包括127条高表达和218条低表达。RP11-436F21.1和H19是上调最明显的lncRNA。|FC|≥10的共表达mRNA有75条，其中57条上调、18条下调。与癌旁组织相比，膀胱癌组织5种lncRNA中RP11-359E19.2表达上调，AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3及AK021804表达下调(P均<0.05)；4种共表达的mRNA中HRAS、VEGFA、ITGB1和DNMT3B表达均上调(P均<0.05)；qRT-PCR结果与芯片结果一致。GO分析显示，上调的共表达mRNA主要参与细胞代谢和有丝分裂的生物学过程，下调的共表达mRNAs主要参与免疫系统的刺激反应和免疫应答；KEGG pathway富集分析显示，10个通路与上调或下调的共表达mRNA有关，其中在上调的共表达mRNA中，p53信号通路和膀胱癌的富集度最高，在下调的共表达mRNA中细胞因子-因子受体相互作用富集度最高。结论 成功筛选出膀胱癌特异表达的lncRNA及其共表达mRNA，这些特异表达的lncRNA及共表达mRNA在膀胱癌的发生、发展和转移中发挥重要的生物学作用，有望成为膀胱癌新的标志物。

膀胱癌；长链非编码RNA；lncRNA芯片；信息学分析

近年来膀胱癌发病率有逐年升高之势。膀胱癌术后易复发和转移，患者预后极差[1]。迄今肿瘤发生、发展及转移的根本原因和机制还不完全清楚，部分关键肿瘤标志物尚未被发现。长链非编码RNA(lncRNA)是一组长度>200 nt且不具有编码蛋白功能的RNA转录本，可在表观遗传水平、转录水平和转录后水平调控基因的表达，广泛参与机体的生理和病理过程[2]。越来越多的研究显示，lncRNA表达与肿瘤的发生、发展密切相关[3～7]。但目前关于膀胱癌患者血浆中特异性lncRNA新的标志物的筛选与鉴定少见报道。本研究筛选并验证了膀胱癌组织中特异性lncRNA及其共表达的mRNA，并初步分析、预测了其功能，旨在为膀胱癌的临床诊断、治疗、判断预后及分子机制研究提供帮助。

1 实验材料

本研究所用的样本来自重庆医科大学附属第一医院，收集未经化疗和放疗的膀胱癌和癌旁组织30例份，样本均经病理证实，并在手术切除后立即液氮保存。本实验所有样本的采集、处理通过重庆医科大学伦理委员会批准，并征得患者和(或)家属知情同意。

2 方法与结果

2.1 lncRNA及其共表达mRNA表达谱建立及其特异表达的筛选 抽提4对膀胱癌与癌旁组织总RNA，对抽提所得RNA进行质检，合格的RNA按照Quick Amp Labeling kit (Agilent Technologies, palo Alto, USA)标记方法对RNA进行扩增、转录生成荧光标记的cRNA；标记后样品杂交于Arraystar公司的Human LncRNA Array v4.0芯片上，漂洗后由Agilent Scanner G2505C扫描仪进行扫描；原始数据采集由Agilent Feature Extraction Software (version 11.0.1.1)软件完成。应用R Software Package进行原始数据标准化与进一步的数据分析。将膀胱癌组织与癌旁组织相比较，筛选出特异表达的lncRNA及其共表达mRNA(|FC| ≥ 2.0，且P< 0.05，FRD<0.05)。结果显示，与癌旁组织相比，膀胱癌组织差异表达的lncRNAs共4 155条，其中2 045条高表达、2 110条低表达；lncRNA共表达mRNA共4 416条，其中2 472条高表达、1 944条低表达。差异表达的lncRNA中|FC|≥10者345条，包括127条高表达和218条低表达。RP11-436F21.1 (FC: ～236)和H19(FC: ～30)是上调最明显的lncRNA。|FC|≥10的共表达mRNA有75条，其中57条上调、18条下调。膀胱癌与癌旁组织lncRNA及其共表达mRNAs层次聚类图见插页Ⅱ图1。

2.2 特异表达的LncRNA及其共表达mRNA的验证 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法进一步验证表达差异的lncRNA和共表达mRNA的表达水平，我们从芯片结果中筛选出特异表达的5个lncRNA(RP11-359E19.2、AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3、AK021804)和4个共表达的mRNA(HRAS、VEGFA、ITGB1、DNMT3B)。按照TRIzol试剂盒说明书分别提取膀胱癌和癌旁组织中细胞总RNA，经逆转录反应和PCR反应检测mRNA表达水平。RP11-359E19.2上游引物： 5′TTTCCCTTCTCA-ACGACCTG3′；下游引物：5′GAGTAAAGACAAGCTGAACCCA3′；AL928768.3上游引物：5′AGATGCCGCCTCCCTATGT3′；下游引物：5′CACGGTCAGTGCTGTGCTAT3′；AC002519.6上游引物：5′TGCTCATTTCACTCCACCCA3′；下游引物：5′ATTTCCTTTGCCTTCTCGC3′；RP11-79H23.3上游引物：5′GCAA-GGAGAGTAATGCTGGA3′；下游引物：5′CAATGAGGATGAGAAGAGGTC3′；HRAS上游引物：5′CAGTACAGGGAGCAGATCAAACG3′ ；下游引物：5′TGAGCCTGCCGAGATTCCA3′；VEGFA上游引物：5′CATGCAGATTATGCGGATCAA3′ ；下游引物：5′GCATTCACATTTGTTGTGCTGTAG3′；ITGB1上游引物：5′GA-ATGCCTACTTCTGCACGATGT3′；下游引物：5′TGTTCCTTTGCTACGGTTGGTTA3′；DNMT3B上游引物：5′AAGAGTTGGGCATAAAGGTAGGA3′；下游引物：5′GGCTGGATTCACATTTGAGAGA3′；β-actin上游引物：5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′；下游引物：5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′。采用SYBR® Pre-mix Ex TaqⅡ试剂盒，应用实时定量PCR扩增仪(ABI 7500)检测每个扩增循环后SYBR® Green荧光信号水平。反应体系共10 μL：上下游引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 2 μL，2×Master Mix 5 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。收集荧光信号，建立熔解曲线，运用熔解曲线检测扩增产物纯度。采用相对定量2-ΔΔCt法对获得的CT值进行分析。

结果显示，与癌旁组织相比，膀胱癌组织5种lncRNAs中RP11-359E19.2表达上调，AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3及AK021804表达均下调(P均<0.05)，见表1；4种共表达mRNA中HRAS、VEGFA、ITGB1和DNMT3B表达均上调(P均<0.05)，见表2。qRT-PCR结果与芯片结果一致。

表1 膀胱癌组织与癌旁组织5种lncRNA表达

注：与癌旁组织比较，*P<0.05。

表2 膀胱癌组织与癌旁组织4种与lncRNA共表达的mRNA表达

注：与癌旁组织比较，*P<0.05。

2.3 lncRNA共表达mRNA的功能预测 采用GO和KEGG pathway富集分析对lncRNA共表达的mRNA进行功能预测，推断lncRNA的功能。GO分析(http://www.geneontology.org)通过生物过程、细胞组分和分子功能三部分对基因或蛋白质进行相应的注释以及分类。对共表达mRNA进行KEGG pathway分析，通过富集分数显示相关信号通路的重要性。GO分析结果显示，上调的共表达mRNA主要参与细胞代谢和有丝分裂等生物学过程；下调的共表达mRNAs主要参与免疫系统的刺激反应和免疫应答。KEGG pathway富集分析显示，10个通路与上调的共表达mRNA有关，10个通路与下调的共表达mRNA有关。在上调的共表达mRNA中，p53信号通路和膀胱癌的富集度最高；在下调的共表达mRNAs中，细胞因子-因子受体相互作用富集度最高。采用Cluster 3.0程序完成hierarchical clustering分析，结果以TreeView 1.60程序可视化，见插页Ⅱ图2。

3 讨论

lncRNA是在真核生物中新发现的一类长度>200个核苷酸，没有长阅读框架，但多具有mRNA结构特征(帽式结构和poly A尾巴)的RNA[8]。近年来研究表明，lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰、转录、激活、剪切、转录干扰、表观遗传学调控、免疫监控等多种重要的生物学过程，其转录和功能失调可能导致多种疾病的发生[9]。虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但绝大部分lncRNA的功能仍不明确，越来越多的研究表明，lncRNA作为癌基因和抑癌基因在肿瘤中异常表达，且lncRNA的突变和异常调节与人类疾病密切相关，lncRNA作为新的生物标志物在辅助诊断、判断治疗效果中发挥重要作用[10]。

本研究膀胱癌组织特异表达lncRNA的筛选结果显示，|FC|≥10的lncRNA有345条，包括127条高表达的和218条低表达。RP11-436F21.1是上调最明显的lncRNA，而H19是在膀胱癌组织上调最明显的lncRNA之一。研究发现，膀胱癌组织H19表达水平不仅与分化程度、病理分期、复发转移相关[11]，还可通过上调P57的表达，促进膀胱癌肿瘤细胞侵袭与转移、血管形成[12]。提示lncRNA在膀胱癌中的表达具有特异性，lncRNA的表达量可能成为潜在的膀胱癌诊断和靶向治疗生物标志。

为进一步验证特异表达的lncRNA和共表达mRNA的表达水平，我们从芯片结果中筛选出特异表达的5个lncRNA和4个共表达mRNA。qRT-PCR结果显示，与癌旁组织相比，膀胱癌组织5种lncRNA中RP11-359E19.2表达上调，AL928768.3、AC002519.6、RP11-79H23.3及AK021804表达下调；4种共表达mRNA中HRAS、VEGFA、ITGB1和DNMT3B表达均上调。qRT-PCR结果与芯片结果一致。

本研究筛选出特异表达lncRNA及其共表达mRNA的表达谱，通过GO和KEGG pathway富集分析其共表达mRNA的生物学功能，以推断lncRNA的功能。GO分析结果显示，与癌旁组织相比，膀胱癌组织中上调的共表达mRNA主要参与细胞代谢和有丝分裂等生物学过程；下调的共表达mRNA主要参与免疫系统的刺激反应和免疫应答等，进一步证实了免疫系统功能下降与肿瘤发生密切相关[13]。KEGG pathway富集分析结果显示，与癌旁组织相比，10个显著信号通路分别与上调的共表达mRNA和下调的共表达mRNA有关。其中在上调的共表达mRNA中，p53信号通路和膀胱癌的富集度最高，在下调的共表达mRNAs中，细胞因子-因子受体相互作用富集度最高。这些结果与Zhu等[14]研究结果一致，提示与lncRNAs共表达的mRNAs可能通过调节相关通路在膀胱癌的发生、发展中发挥着至关重要的作用。

综上所述，本研究发现并筛选出膀胱癌特异表达的lncRNA及其共表达mRNA，这些差异表达的lncRNA及共表达mRNA在膀胱癌的发生、发展和转移中发挥重要的生物学作用，有望成为膀胱癌新的标志物，为进一步研究膀胱癌的发生机制奠定基础。

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Preliminary screening and functional prediction of long non-coding RNA and its co-expression mRNA in bladder carcinoma

SHUJing1,HUANGMengge,TIANQiang,JIANGYuan,CHENJunxia

(1TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China)

ObjectiveTo screen out differentially expressed long non-coding RNAs (lncRNAs) and co-expression mRNAs and to perform the preliminary validation and functional prediction in bladder carcinoma.MethodsFour pairs of carcinoma and para-carcinoma tissues were used for microarray assay to screen out the differentially expressed lncRNAs and co-expression mRNAs. Hierarchical clustering was performed to show lncRNA and mRNA expression patterns among samples. Five lncRNAs (RP11-359E19.2, AL928768.3, AC002519.6, RP11-79H23.3, AK021804) and four co-expression mRNAs (HRAS, VEGFA, ITGB1, DNMT3B) were chosen for verification of the microarray results by quantitative real-time PCR. Gene Ontology (GO) and KEGG pathway were used to analyze the biological function of co-expression mRNA.ResultsA total of 4 155 lncRNAs and 4 416 co-expression mRNAs were detected to be differentially expressed, among which, 2 045 lncRNAs were up-regulated and and 2 110 were down-regulated, meanwhile, 2 472 co-expression mRNAs were up-regulated and and 1944 were down-regulated, respectively. Totally 345 lncRNAs displayed fold change ≥10, including 127 up-regulated lncRNAs and 218 down-regulated lncRNAs. RP11-436F21.1 and H19 were the most up-regulated lncRNAs. Overview of coding gene profile showed that 75 mRNAs had fold change ≥10 (up: 57; down: 18). Comapred with the para-carcinoma tissues, the expression of RP11-359E19.2 in 5 lncRNAs was up-regulated, whereas AL928768.3, AC002519.6, RP11-79H23.3, and AK021804 expression was down-regulated in the bladder carcinoma tissues (allP<0.05). Meanwhile, the expression of HRAS, VEGFA, ITGB1, and DNMT3B in four co-expression mRNAs was all up-regulated (allP<0.05). The result was consistent with the microarray assay. GO assay showed that the up-regulated co-expression mRNAs mainly participate in the biological processes, such as cellular metabolic and mitotic cell cycle. Meanwhile, the down-regulated co-expression mRNAs mainly participate in the immune system process of stimulus response and immune response. KEGG pathway assay showed that 10 pathways were associated with the up-regulated or down-regulated mRNAs. Among the co-expression mRNAs, the enrichment of P53 signal pathway and bladder cancer was the highest, whereas in the down-regulated co-expression mRNAs, the cytokine-factor receptor interaction was the highest.ConclusionsThe differentially expressed LncRNAs and co-expression mRNAs are found and screened out in the bladder cancer. The specially expressed lncRNAs and and mRNAs could play important roles in the pathogenesis and development of bladder carcinoma, which might be new markers of bladder cancer.

bladder carcinoma; long non-coding RNA; LncRNA chip; informatics analysis

国家自然科学基金资助项目(81672536)。

舒静(1986-)，女，硕士，技师，主要研究方向为肿瘤相关基因的筛选及其功能预测。E-mail： shujing0723@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.20.002

R737.14

A

1002-266X(2017)20-0005-04

2016-08-31)