柯萨奇病毒A组6型的研究进展

郝晓甜，李克坚综述，周诚，毛群颖审校

中国食品药品检定研究院，北京100050

手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）是一种由肠道病毒感染引起的常见传染病，多发于5 岁以下婴幼儿，以发热和手、足、口腔等部位出现疱疹为主要临床特征［1-2］。HFMD 通过消化道、呼吸道及直接或间接接触等方式传播，多数患者表现为自限性临床症状，少数患者会继发肺水肿、心肌炎、脑膜炎等并发症，严重时可导致死亡［3］。一般认为，HFMD主要由肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）和柯萨奇病毒A 组16 型（Coxsackievirus A16，CVA16）引起［4］。但近年，柯萨奇病毒A组6型（Coxsackievirus A6，CVA6）在全球范围内引起多次HFMD 暴发或流行，CVA6逐渐成为全球多个国家和地区引起HFMD 的优势病原体［5-6］。CVA6导致的HFMD常引发一系列非典型临床表现，即非典型手足口病（atypical HFMD，aHFMD），患者皮疹分布范围更广泛，如躯干、臀部等部位，且会出现脱皮、脱甲等症状。本文就CVA6 的病原学、流行病学、感染后临床症状、实验室诊断及疫苗相关研究作一综述，以期为CVA6 相关疾病的防控、诊断和治疗提供依据。

1 病原学

CVA6 属于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）肠道病毒属（Enterovirus），为单股正链RNA 病毒［7］。CVA6 基因组全长约7 400 bp，包含1 个开放阅读框（open reading frame，ORF）和2 个非编码区（5'UTR 和3'UTR）。ORF 编码1 个多聚前体蛋白，可进一步水解为P1～P3 3 个前体蛋白。P1 编码4 种结构蛋白（VP1～VP4），P2 和P3 编码7 种非结构蛋白（2A～2C和3A～3D）［8］。4 种结构蛋白中，VP4 位于病毒粒子外壳的内侧与病毒核心紧密连接，VP1、VP2、VP3 分布在病毒颗粒表面，包含了主要的抗原决定簇，其中，VP1 是识别、鉴定病毒的重要区域，可作为不同血清型分类的依据［5］。

2 流行病学

2.1流行概况

CVA6 原型株为Gdula 株，于1949 年在美国首次分离。2008 年前，CVA6 感染主要引起疱疹性咽峡炎［9］。自2008 年芬兰首次报道了CVA6 感染引发HFMD 以来［10］，欧洲、美洲、亚洲均出现多次由CVA6引起的HFMD暴发或流行。

2.1.1欧洲 2010—2012年，西班牙发生多起HFMD暴发及散发流行，80 份HFMD 或非典型皮疹患者的临床样本中，柯萨奇病毒（Coxsackievirus，CV）阳性样本为53 份，CVA6 阳性样本占60.0%［11］。2014 及2015 年，法国暴发大规模HFMD 疫情，CVA6 阳性样本分别占CV 阳性样本的28.4%和53.9%［12］。2014年，英国爱丁堡报告1 起与CVA6 相关的aHFMD，共16例感染者［13］。

2.1.2美洲 2011—2012年，美国发生大规模HFMD流行，34份CV阳性临床样本中，CVA6阳性率为73.5%［14］。2011—2013 年，古巴发现35 例HFMD 患者，收集获得11 份CV 阳性标本，其中9 份检出CVA6，2 份检出EVA71［15］。2015 年，阿根廷发现两组由CVA6 感染引起的aHFMD病例（包括来自丘布特省的14例患者及来自圣路易斯省的12 例患者），这是阿根廷也是南美洲首次报告CVA6感染与aHFMD相关［16］。

2.1.3亚洲 2008 年，新加坡暴发了史上最大规模HFMD 疫情，共有29 686例感染者，收集的51份临床标本中，CVA6和CVA10感染者共占35.3%［17］。2012年，泰国暴发大范围HFMD，CVA6 阳性患者占HFMD 患者的32.9%［18］。2011—2015 年，越南3 家医院收治的HFMD 患者中，CVA6 检出率占23.0%［19］。1 项对日本大阪市HFMD 病原分析发现，2011 年，CVA6 开始成为主要病原体，2011、2013、2015 年CVA6 阳性检出率分别为57.1%、42.9%、64.0%［20］。

近年，中国发生多起CVA6引起的HFMD暴发或流行。2013年，吉林省长春市暴发HFMD疫情，CVA6检出率达66.9%［21］。2013—2017 年，天津市HFMD病例中，CVA6阳性率为29.6%，超过EVA71和CVA16，表明CVA6 已成为天津市HFMD 的优势病原体［22］。2011—2018年，上海市金山区采集HFMD 病例标本显示，自2014 年起，CVA6 逐渐成为优势病原，2018年占病原学构成的85.4%［23］。2017—2019年，广东省HFMD 普通病例中，CVA6 感染率分别为57.1%、23.0%、47.4%［24］。另外，浙江、云南、黑龙江、新疆、福建及澳门等地均出现与CVA6 感染相关的HFMD疫情［25-30］。

2.2分子流行病学 目前，国际上对CVA6 的分型尚无统一标准，主要是利用VP1 区进行分型。ANH等［19］根据VP1 序列进行系统进化分析，将CVA6 分为A ～F 6 个基因型。SONG 等［31］对CVA6 中国毒株（807株）和国际毒株（19株）VP1序列进行分析，结果表明，CVA6 可分为A～D 4 个基因型，并可进一步细分为B1～B2、C1～C2 和D1～D3 亚型，其中D3 亚型是近年来中国大陆流行的主要型别。2009 — 2015年，HE 等［29］对厦门CVA6 毒株及与国内外其他地区参考毒株VP1 序列进行系统进化分析，结果显示，CVA6可分为4 种基因型（A～D），D型可分为D1～D5亚型，中国大陆以D5亚型为主。LIU等［32］通过对HFMD样本获得的101 个CVA6 VP1 全长序列及从NCBI 中获取的200 个CVA6 VP1 序列进行系统发育树分析，结果显示，CVA6 同样可分为A～D 4 个基因型，B 型分为B1 和B2 亚型，D 型分为D1～D3 亚型，2008 年后，全球范围流行株主要为D3亚型。

3 临床症状

CVA6 感染儿童的临床症状多表现疱疹性咽峡炎和HFMD。另外，CVA6 感染可引起湿疹恶化、水痘-带状疱疹、附睾炎等症状［33］。在某些情况下，CVA6 感染也可导致重症脑膜炎和脑炎。与EVA71和CVA16 不同，CVA6 不仅容易感染儿童，免疫功能正常的成年人也有较高的感染率，且多表现为aHFMD［34］。以色列报道5 例感染CVA6 的成年病例均出现发热和严重的血管炎样皮疹等症状［35］。意大利10 例成年人因接触患儿感染CVA6 导致HFMD，其中1 例患者出现脱甲症和附睾炎［36］。另外，美国报道1例65岁成人感染CVA6引起急性心肌炎［37］。

4 实验室诊断

4.1诊断方法

4.1.1病毒分离培养 病毒分离培养是病毒感染性疾病诊断的金标准，通常采用传统的细胞病变法进行。2008 年，新加坡学者将HFMD 患者标本接种至人横纹肌肉瘤细胞，获得了CVA6 阳性分离株［17］。但该方法费时、耗力，且与EVA71和CVA16相比，CVA6在培养细胞中生长较差，该方法较难分离出CVA6，不适合临床的快速检测［38］。

4.1.2血清学检测 血清学检测是CV 诊断的常规方法，主要包括酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）和中和抗体试验。ELISA法主要用于检测病毒的抗原和抗体，通常采用患者急性期和恢复期血清的滴度来判断，抗体滴度升高大于4 倍时，证明病毒感染［39］。中和抗体试验是将健康人或患者血清与CV 标准株中和，测定抗体水平，但抗体中和时间较长。有研究表明，假病毒中和抗体检测方法具有安全、高效、高灵敏度等优点，适用于高通量的中和抗体检测试验，可用于CVA6疫苗效价的评估和流行病学监测［40-41］。

4.1.3分子生物学检测 逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）具有简单、快速、特异性强等特点，已成为CV 诊断的重要手段。有研究建立了一种可同时检测CVA6和CVA10两种病原体的双重RT-PCR 法，该方法具有简单、快速、高效的特点，有望应用于常规的实验室诊断［42］。另外，基因芯片技术和高通量测序技术作为新的病原学检测手段，具有较高的灵敏度，也可用于CVA6诊断，但检测成本较高［43-44］。

4.2诊断试剂 国内市场上CVA6 诊断试剂主要为核酸检测试剂。目前，共有6 家CVA6 核酸检测试剂生产企业已完成注册，均为PCR-荧光探针法，其中1家生产CVA6核酸检测试剂盒，4家生产CVA6／CVA10型核酸检测试剂盒，另外1家生产CV通用型、EVA71和CVA16 型／10 型／6 型核酸检测试剂盒［45］。另外，还有多家企业处于产品研发阶段。由于尚无CVA6国际标准物质及国家标准物质，以上企业均采用企业参考品进行性能验证。中国食品药品检定研究院先后研制了EVA71 和CVA16 核酸检测试剂国家参考品，用于相关试剂的质量控制和评价。因此，亟需研制CVA6 核酸检测试剂国家参考品，用于CVA6、CVA6／CVA10 型及CV 通用型核酸检测试剂盒中CVA6项目的检验。

5 疫苗相关研究

疫苗是预防传染病的最重要措施之一，目前尚无针对CVA6 引起HFMD 疫苗上市的报道［46］。因此，研发疫苗是预防和控制CVA6感染的重要途径之一。

5.1动物模型 动物模型是疫苗有效性评价的重要工具，建立一个可稳定呈现人类临床症状甚至可导致死亡的动物模型可极大促进疫苗的研发及应用［47］。目前，用于CV 疫苗评价的动物模型大多采用小鼠模型。YANG 等［48］利用CVA6／141 毒株攻击1 日龄BALB／c乳鼠，乳鼠出现了消瘦、后肢瘫痪甚至死亡等临床症状，病理检查显示，CVA6 对骨骼肌和皮肤有特殊的趋向性，CVA6对皮肤的强烈趋向性与婴儿的临床特征相近。ZHANG等［49］用CVA6／WF057R毒株感染5 日龄ICR 乳鼠，乳鼠出现体重减轻、四肢瘫痪等症状。WU 等［50］选择4 周龄BALB／c 小鼠建立了可视化假病毒感染模型，可直接通过活体成像观察病毒的分布情况及评价疫苗免疫效果。综上所述，动物模型将为未来研究CVA6疫苗提供有利工具。

5.2疫苗研究 目前，针对CVA6 疫苗的研究主要包括灭活疫苗和病毒样颗粒（virus-likeparticles，VLPs）疫苗。由于HFMD 主要致病血清型的不断变化，对HFMD 疫苗提出新的需求，研制高效的多价HFMD疫苗受到广泛关注［51］。

ZHANG等［52］研究证实，经皮下注射CVA6／CVA10二价全病毒灭活疫苗可使新生小鼠出现抗原特异性的全身免疫反应，从而诱导主动免疫。LIM 等［53］使用不同灭活方法制备了CVA6／CVA10／CVA16 三价灭活疫苗，并进行了免疫原性评价，结果表明，CV多价疫苗可作为HFMD 候选疫苗。SHEN 等［54］利用共表达CVA6 P1和3CD 的杆状病毒感染昆虫细胞制备了CVA6 重组VLPs 疫苗，该疫苗免疫小鼠后能够诱导产生高效价抗体，可保护小鼠免受CVA6 的感染。在此基础上，该团队还构建了EV71／CVA16／CVA6／CVA10 四价VLPs 疫苗，该疫苗免疫小鼠后的免疫血清可对4 种病毒的单一或混合感染提供有效的保护作用，表明四价VLPs 疫苗是一种有前景的广谱HFMD候选疫苗［55］。

6 小结与展望

CVA6已成为引发HFMD 的主要病原体之一，易导致婴幼儿及成人HFMD 的流行，对HFMD 的防控提出了严峻的挑战。目前针对CVA6 感染的抗病毒药物及疫苗的相关基础研究较少［56］。因此，应加强对HFMD病原学监测，关注CVA6致病性和流行病学特征，并尽快研制CVA6诊断试剂用国家标准物质及开展CVA6 疫苗和药物的研发，为CVA6 相关疾病的防控、诊断和治疗提供保障。