不同稀释液对混合酶标抗体稳定性的影响

牛银银，陈鹏，崔红米，杨潇燕，米贯勋，李三华，刘文弟，齐华

河南省肿瘤病理诊断试剂工程技术研究中心，河南郑州450001

以酶标二抗为核心的免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）染色技术是病理学的重要组成部分，优质的酶标二抗具有特异性强，灵敏度高和稳定性好等特点。目前，辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的二抗工作液在冷藏条件下可保存1 年，稳定性好，可满足IHC 技术的需求［1］。近年来，随着蛋白标志物研究水平的提高，多重IHC 的应用在科研与临床检测领域均有需求，研究人员可通过对组织样本进行多重IHC，在原位分析不同抗原靶标之间的空间关系，特别是对肿瘤微环境的研究尤其重要。多重IHC 的核心在于用不同种类酶标记的二抗来结合多个蛋白标志物，再利用不同酶的显色底物进行显色，常用的不同酶标记二抗是HRP 偶联二抗和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）偶联二抗的鸡尾酒混合物［2-5］。

混合酶标记抗体在科研领域的应用中，基本是以浓缩液或冻干粉的形式存储于-20 ℃及以下低温环境中，可使试剂保存期达1 年以上，使用时，用稀释液对其进行处理配置为工作液，保存于冷藏（2 ～8 ℃）条件下，保存期仅为1 个月左右。在临床检测领域，检测试剂为即用型工作液，在冷藏条件下至少需保存1 年。因此，提高混合酶标抗体的稳定性，对于多重IHC的发展尤其重要［6-9］。

为了确保混合酶标记抗体的长期稳定性，本研究以Tris-HCl 缓冲盐溶液为基础溶液，探讨不同稀释液配方对其稳定性的影响。

1 材料与方法

1.1样本 人乳腺癌（RX1024）、食管鳞癌（SG512）、结肠癌（C1022）、肺鳞癌（FLCa896）和扁桃体（BTT-433、BTT827）石蜡组织切片由郑州赛诺特医学检验所提供并授权研究。所有样本入库建档日期在2018年3月—2019年12月之间，每个样本制备3µm厚的白片10张。

1.2主要试剂及仪器 AP标记的羊抗兔二抗浓缩液（使用效价：10µg／mL）、HRP 标记的羊抗鼠二抗浓缩液（使用效价：7.5µg／mL）、鼠抗人p53 单克隆抗体（克隆号：DO-7，稀释比：1／150）、鼠抗人细胞角蛋白5 单克隆抗体（克隆号：GM028，稀释比：1／200）、鼠抗人E-Cadherin 单克隆抗体（克隆号：GM028，稀释比：1／200）、兔抗人CD3 单克隆抗体（克隆号：MRQ-39，稀释比：1／100）、兔抗人Ki67 单克隆抗体（克隆号：SP6，稀释比：1／150）、兔抗人C-erbB-2 单克隆抗体（克隆号：EP3，稀释比：1／200）均由河南赛诺特生物技术有限公司提供；Tris、L-Ascorbic Acid、Lmethionine、L-histidine、酪蛋白酸钠、BSA 和海藻糖购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；氯化镁、氯化锌、氯化钠和Tween-20 均购自国药集团化学试剂有限公司；Proclin-950 购自北京索莱宝科技有限公司；ELISA 试剂盒购自美国Abcam 公司；酶标仪和紫外光分光光度计购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。

1.34 种不同稀释液保存混合酶标抗体试剂的配制及放置 配制4 种不同配方的抗体稀释液A、B、C、D［3-4］，在每种稀释液中添加相同含量的混合酶标抗体，配制成工作液，用离心管分装，每种试剂分装10支（1 mL／支），其中5 支放入恒温培养箱（设置37 ℃）中，另5支放入2 ～8 ℃冷藏条件下保存。

A 液配方为：Tris（50 mmol／L）+牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+氯化钠（150 mmol／L）+L-methionine（5 mmol／L）；B 液配方为：Tris（50 mmol／L）+牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+氯化钠（150 mmol／L）+L-methionine（5 mmol／L）+L-histidine（5 mmol／L）+海藻糖（8%，g／100 mL）+氯化镁（0.5 mmol／L）；C液配方为：Tris（50 mmol／L）+牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+ 氯化钠（150 mmol／L）+ L-methionine（5 mmol／L）+明胶（1%，g／100 mL）+海藻糖（8%，g／100 mL）+氯化锌（0.1 mmol／L）；D液配方为：Tris（50 mmol／L）+ 牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+氯化钠（150 mmol／L）+L-Ascorbic Acid（1 mmol／L）+L-methionine（5 mmol／L）+L-histidine（5 mmol／L）+酪蛋白酸钠（1%，g／100 mL）+氯化锌（0.1 mmol／L）+海藻糖（8%，g／100 mL）。

1.4混合酶标抗体中HRP 和AP 活性剩余比率的测定 活性剩余比率指37 ℃热加速试验后的活性与相同条件保存于冷藏条件的试剂活性的比率。HRP的活性检测需将样本稀释2.5倍，将该工作液与联苯三酚底物反应生成红陪酚产物，通过紫外光分光光度计在420 nm波长处测定吸光度值，通过公式1计算出酶活性；AP的活性检测需将样本浓度稀释至1µg／mL，样本中的AP与底物PNPP 反应，形成黄色产物，通过紫外光分光光度计在400 nm 波长处测定吸光度值，通过公式2计算出工作液中的酶活性［10-11］。

式中3为测定的体积（mL）；df为稀释因子；12为式中Vt 为反应混合物最终体积；Vs 为样品体积（0.10 mL）；ε 为对硝基苯酚的微摩尔消光系数（18.7 cm2／µmol）；体积活度（U／mL）=△A400／min×1.6×稀释倍数。

1.5混合酶标抗体中抗体工作液效价的测定 采用间接ELISA 法测定工作液的效价，按试剂盒说明书操作。

1.6组织切片的IHC 检测 组织切片经常规脱蜡水化后，用纯水冲洗干净，利用高压锅进行抗原修复，修复液为Tris-EDTA（pH 9.0），修复2.5 min；自然冷却，TBST 洗涤，过氧化物酶封闭剂封闭5 min；TBST洗涤，加入一抗，常温孵育60 min；TBST 洗涤，加入二抗，常温孵育30 min；TBST洗涤，DAB显色5 ～8 min；纯水冲洗，苏木素衬染1 ～3 min；纯水冲洗，脱水，透明，封片，在光学显微镜下观察染色结果。

1.7数据采集及分析 通过Microsoft Excel处理数据，使用Origin 9.1软件作图。

2 结果

2.1混合酶标抗体中HRP和AP活性剩余比率 D液最优，10 周后HRP 和AP 活性剩余分别为93.46%和96.07%，A 和B 液的HRP 和AP 活性下降幅度很大，C 液对HRP 的活性有一定的保护作用，10 周后活性还剩余90.51%，但对AP 活性未起到很好的保护作用，10周后AP活性下降接近20%。见表1。

表1 混合酶标抗体中HRP和AP活性剩余比率（%）Tab.1 Residual ratios of HRP and AP activity in mixed enzyme-labeled antibody（%）

2.2混合酶标抗体中HRP 和AP 偶联二抗的效价ELISA 结果显示，D 液最优，10 周后HRP 偶联二抗和AP 偶联二抗与第0 天对照所得曲线非常接近，而其他组距离较远，A液整体最差。见图1。

A：HRP偶联二抗37 ℃保存2周；B：AP偶联二抗37 ℃保存2周；C：HRP偶联二抗37 ℃保存4周；D：AP偶联二抗37 ℃保存4周；E：HRP偶联二抗37 ℃保存6周；F：AP偶联二抗37 ℃保存6周；G：HRP偶联二抗37 ℃保存8周；H：AP偶联二抗37 ℃保存8周；I：HRP偶联二抗37 ℃保存10周；J：AP偶联二抗37 ℃保存10周。

2.3不同存储时间保存试剂的IHC 检测 IHC 检测结果显示，D 液染色效果最优，混合酶标二抗于37 ℃放置10 周后，其染色强度与第0 天对照试剂的染色效果最接近，其他配方均有不同程度的减弱。见图2和图3。

图3 AP偶联抗体的IHC结果（快红染色，×200）Fig.3 IHC results of AP conjugated antibody（Fast red staining，×200）

3 讨论

为了研究出一种适用于混合酶标抗体的稀释液，本研究设计了4 种保存液配方，将二抗试剂用保存液稀释，配置成工作液，探讨其对HRP偶联二抗和AP 偶联二抗稳定性的影响。HRP 和AP 是目前使用最广泛的标记酶，用于标记抗体或其他蛋白质，用于定性或定量检测。这种酶标记的抗体溶液是体外诊断试剂盒的重要组成成分，与试剂的性能质量直接相关。

Tris缓冲液作为一种生物缓冲试剂，在水中的溶解度极高，对很多酶反应是惰性的，可作为酶偶联二抗的缓冲系统。BSA 作为蛋白保护剂，可提高溶剂中蛋白质的浓度，对酶起到保护作用，防止酶的分解及非特异性吸附，减轻不利环境下引起的酶或蛋白变性［12-14］。Tween-20 是非离子型表面活性剂，具有复性抗原的作用，可提高抗原抗体的结合能力，保护抗体效价。氯化锌等可溶解性盐中的锌离子可阻止AP 受到螯合剂的作用失去锌离子，氯化镁等可溶性盐中的镁离子可激活AP，提高其催化水解的效率，同时，镁离子可与蛋白形成多点接触，增加蛋白的刚性，提高蛋白应对温度变化的稳定性［15-16］。适宜的钠离子浓度可很好地稳定酶的活性，同时，作为电解质，有益于抗原抗体的特异性结合反应。明胶和酪蛋白是一类生物高聚分子，作为封闭剂，可在一定程度上避免抗体的吸附，在保存液中起到稳定剂的作用［17］。海藻糖是一种多糖，能够干扰酶分子的结构重叠，同时，这种物质中的多元醇结构可通过氢键与酶的表面分子结合，促进酶分子的稳定效果［18-19］。P950 是一种广谱型抑菌剂，在一定浓度下可长期抑制细菌、真菌等微生物的生长，且不影响HRP等酶的活性，对于抗体的结合反应无干扰，是理想的生物防腐剂。L-methionine 是一种强抗氧化剂，由于其本身的硫和螯合能力，使其具有清除自由基的活性，保持蛋白的稳定性，L-Ascorbic Acid 作为一种常见的抗氧化剂，用途很广，可减轻酶的氧化作用，L-histidine 在抗体试剂中，既可作为赋形剂，也可起到抗氧化作用，因为组氨酸能结合Cu2+等易催化抗体蛋白发生氧化修饰的金属离子［20-21］。

本研究发现，D 液配方［Tris（50 mmol／L）+ 牛血清白蛋白（1.5%，g／100 mL）+Tween-20（0.3%）+Proclin-950（0.1%，g／100 mL）+氯化钠（150 mmol／L）+L-AscorbicAcid（1mmol／L）+L-methionine（5mmol／L）+L-histidine（5 mmol／L）+酪蛋白酸钠（1%，g／100 mL）+氯化锌（0.1 mmol／L）+海藻糖（8%，g／100 mL）］保存混合酶标抗体的稳定性最好，在37 ℃条件下保存10周，HRP偶联二抗和AP偶联二抗的工作液效价最高，HRP 和AP 的活性剩余比率分别为93.46%和96.07%，IHC结果无明显改变。综合分析，此配方可延长试剂中酶及其标记抗体的保存期限，满足酶标混合二抗作为体外诊断试剂盒组分之一的需求。