二代交叉引物恒温扩增技术对结核分枝杆菌检测的应用价值

王燕 欧维正 杨秀章 杨毅

(贵阳市公共卫生救治中心检验科,贵州 贵阳 550003)

结核病(TB)是由结核分枝杆菌(MTB)感染引起的慢性传染病。多色巢式荧光定量PCR(Xpert MTB/RIF)作为快速分子诊断技术于2010年12月由WHO推荐[1],因其具有较高的灵敏性和特异性,操作简便且快速,已在世界范围内广泛应用。交叉引物恒温扩增技术(CPA)是一种新颖的环介导等温扩增(LAMP)方法[2],也是我国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术,相对Xpert MTB/RIF而言,CPA检测MTB的临床应用更具有价格优势。一代CPA(恒温扩增-试纸条法)被证明是一种简便、快速、特异的MTB检测方法[3],并已获得WHO所认可[4],但因其手动处理步骤较多,限制了它在工作量大的临床实验室中的使用,主要推荐在基层实验室开展[5]。后续发展的二代CPA(恒温扩增-实时荧光法)则可实现了多通道“一管式”全自动核酸分析,即在一个密闭检测管内完成核酸裂解结合、清洗、洗脱和扩增反应。因此,本研究旨在评估二代CPA作为TB的快速分子诊断技术的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年7月至2022年7月本院收治患者送检的各类标本235例,其中,痰液98例、肺泡灌洗液76例、胸(腹)水37例、其它标本(穿刺液及分泌物等)24例。所有标本均经研究对象知情同意后获得,排除标本不合格者、二代CPA和Xpert MTB/RIF检测失败者。

1.2试剂和仪器

1.2.1试剂 二代CPA检测试剂为杭州优思达生物技术有限公司的“结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒(恒温扩增-实时荧光法 )”[注册号为国械注准20193401027 ];Xpert MTB/RIF检测试剂为美国Cepheid公司的“Gene Xpert®MTB/RIF试剂盒”[注册号为国食药监械(进)字2014第3401153号]。

1.2.2仪器 UC0108核酸扩增检测分析仪(杭州优思达生物技术有限公司)、Gene Xpert®检测系统(美国Cepheid公司)等。

1.3检测方法

1.3.1Xpert MTB/RIF检测 取不少于2 mL标本置于有螺旋盖的前处理管中,然后加入相当于1～2倍标本体积的处理液,旋紧前处理管,在涡旋振荡器上涡旋振荡15～30 s,室温静置15 min,使标本充分液化。打开反应盒,取2 mL处理后标本从加样孔缓慢加入反应盒,然后将反应盒置于检测模块,仪器自动化检测。反应结束后,检测结果可直接在检测系统窗口下观察。

1.3.2二代CPA检测 取用于Xpert MTB/RIF检测后剩余液化标本1 mL加至1.5 mL离心管中, 14 170×g离心3 min,弃上清。同时将MTB-DNA提取液充分混匀,全部转入MTB-内标管中,静置10～20 s后,充分混匀至管底无可见紫色附着物。将混合液全部转入已弃上清的标本离心管中,充分混匀至管底无可见附着物。最后将总混合液全部转入MTB-全自动检测管中,盖好管盖上机检测。以试剂盒自带的MTB-阳性/阴性对照作为外部质控。MTB检测结果呈现典型S型扩增曲线(包括未到平台期的S曲线),当MTB Tt≤40时,MTB为阳性;否则MTB为阴性(同时满足内标检测结果接受标准)。

1.4统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。Xpert MTB/RIF和二代CPA对不同标本类型的MTB阳性检出率比较采用χ2检验,p<0.05为差异有统计学意义;二者的一致性比较采用Kappa检验,Kappa值0～0.20示极低的一致性,0.21～0.40示一般的一致性,0.41～0.60示中等的一致性,0.61～0.80示高度的一致性,0.81～1示几乎完全一致。

2 结 果

2.1235例标本同步进行Xpert MTB/RIF和二代CPA检测,Xpert MTB/RIF检测MTB阳性率为43.38%(103/235),二代CPA检测MTB阳性率为42.13%(99/235)。不同标本类型的MTB阳性检出率比较见表1。

表1 Xpert MTB/RIF和二代CPA检测各种标本类型的MTB阳性率比较

2.2二代CPA与Xpert MTB/RIF对235例标本检测MTB的结果比较 二者对全部标本的阳性符合率88.35%,阴性符合率93.94%,总符合率91.49%,一致性比较,Kappa=0.83。

2.3Xpert MTB/RIF检测结果为“MTB高”的标本有11例,为“MTB中”的标本有44例,为“MTB低”的标本有30例,上述标本二代CPA检测均为MTB阳性;Xpert MTB/RIF检测结果为“MTB 极低”的标本有18例,二代CPA检测MTB阳性有6例,阴性有12例;Xpert MTB/RIF检测结果为“MTB 未检出”的标本有132例,二代CPA检测MTB阳性有8例,阴性有124例。

3 讨 论

有研究[6]中,LAMP、SAT和Xpert MTB/RIF一样,对检测MTB均表现出较高的灵敏性和特异性,明显高于抗酸染色和罗氏培养等传统方法,极大地提高了临床标本的MTB检出率。Xpert MTB/RIF是较为成熟的TB快速分子诊断技术,在长期的实践中已得到了临床的广泛认可[7]。

本文结果显示,不同标本类型间检测MTB的阳性率比较,二代CPA和Xpert MTB/RIF差异均显示无统计学意义(P>0.05)。全部标本的统计学比较,二者检测MTB的结果也有着极高的一致性(Kappa=0.83)。表明应用二代CPA和Xpert MTB/RIF对胃吸液检测MTB的灵敏性和特异性相似,与文献[8]研究结果基本相符。

研究发现二代CPA和Xpert MTB/RIF对MTB含菌量较多的标本(Xpert MTB/RIF检测结果为“MTB 低”及以上),二者检测结果完全一致,差异主要表现在少数Xpert MTB/RIF检测结果为“MTB 极低”或“MTB 未检出”的标本,这可能与二者的最低检出限值存在差异有关。一方面二者靶基因不同,二代CPA的靶基因是IS6110,属多拷贝基因,而Xpert MTB/RIF的靶基因是rpoB,属单拷贝基因。有文献[9]报道,以单拷贝基因为检测靶基因的方法比以多拷贝基因为检测靶基因的方法敏感性低。本文结果显示,二代CPA比Xpert MTB/RIF的阳性率略低(42.13% vs 43.38%),这或许与本研究的标本量不够大有关。另一方面二者自动化操作有差异,二代CPA多一步上机前标本离心富集的手工过程,如果该步骤处理不当,可能反而会导致菌量的丢失,这或许是本研究二代CPA比Xpert MTB/RIF阳性率低的另一原因。熟练掌握二代CPA的标准操作规程,将有益于提高二代CPA的检测质量。

二代CPA和Xpert MTB/RIF都具有操作简便、高度自动化的优势,整个过程不到2 h,而二者检测MTB的结果具有极高的一致性,因此,二代CPA同Xpert MTB/RIF一样可推荐用于临床对MTB的快速检测。但Xpert MTB/RIF可以同时检测利福平耐药性则是它的另一大优势。就检测成本而言,二代CPA明显低于Xpert MTB/RIF,二代CPA更适合在经济欠发达地区推广应用。